Презентация на тему Методы анализа кариотипа человека. Стандартные цитогенетические, молекулярно-цитогенетические, молекулярные методы

руководство)

руководство)

онтогенеза человека:
Преконцепционная
Предимплантационная
Пренатальная
Постнатальная

Цитогенетическая диагностика
Метафазные хромосомы
Стандартные методы цитогенетического анализа (культивирование клеток,

приготовление препаратов хромосом, дифференциальное окрашивание), молекулярно-цитогенетические методы

Хроматин интерфазных ядер, молекулы ДНК
Методы молекулярно-цитогенетического и молекулярного анализа

Конститутивный
кариотип

Онкоцитогенетика – анализ кариотипа отдельных соматических клеток

клеток буккального эпителия (экспресс-анализ аномалий половых хромосом)
Стандартное цитогенетическое исследование

– анализ метафазных хромосом с помощью методов дифференциального окрашивания («золотой стандарт»)
Молекулярно-цитогенетическое исследование (FISH – флуоресцентная in situ гибридизация специфических ДНК-проб с ДНК метафазных или интерфазных хромосом)
Молекулярные методы исследования (array-CGH –сравнительная геномная гибридизация на микроматрицах; QF-PCR – количественный анализ полиморфных локусов хромосом, NGS – анализ количественных нарушений методами секвенирования )

хромосом. Как правило выполняется на ядрах клеток буккального эпителия.

Нативное окрашивание ацеторсеином

Иммунофлуоресцентное окрашивание гистона macroH2A, связанного с неактивной Х-хромосомой

в себя определение числа хромосом (исключение геномных мутаций) и

анализ структуры хромосом (исключение хромосомных мутаций)

Стадия клеточного цикла

Методы получения препаратов хромосом

Прямые: используются клетки, делящиеся in vivo

клетки костного мозга,
клетки цитотрофобласта

Непрямые: используются клетки, делящиеся in vitro

лимфоциты периферической крови
фибробласты кожи
амниоциты

антикоагулянта (гепарина)
Стерильность
Культура лимфоцитов:
Кратковременная (72 ч)
Митоген (ФГА)
Цитостатик (колхицин)
Гипотоническая обработка клеток
Фиксация

клеток
Приготовление
препаратов

числа и структуры хромосом
Цитогенетическое заключение

протеолитическим ферментом трипсином (GTG)

контрастированием Actinomycin D (QFH/AcD)

раннего срока
Результат кариотипирования:
46,XX,+13,der(13;14)(q10;q10)
Заключение:
В клетках цитотрофобласта ворсинчатого хориона выявлена

транслокационная форма трисомии по аутосоме 13 (синдром Патау)
Рекомендации:
Кариотипирование супружеской пары
Консультация врача-генетика

целых хромосом
выявить структурные перестройки хромосом на уровне разрешения 300-850

блоков на гаплоидный набор
выявить хромосомный мозаицизм при определенном количестве анализируемых клеток

нельзя:
выявить нарушения в кариотипе неделящихся клеток
в большинстве случаев достоверно установить микроделецию или микродупликацию
установить природу добавочного материала и маркерных хромосом

возраст,
БХМ I триместра (1,0/3,86), риск 1:133

Кариотип в клетках

цитотрофобласта – 47,XX,+mar[21]/46,XX[8]

Рекомендации:
Молекулярно-цитогенетическая диагностика (FISH) для установления природы маркерной хромосомы
Кордоцентез

общего анализа кариотипа (многоцветная FISH, SKY, RxFISH, CGH)


Методы селективного

хромосомного анализа (анализ численных и структурных аномалий конкретных хромосом)


Методы общего анализа индивидуальных хромосом (multi color banding, «обратная» FISH )

Н.Б.Рубцов, Т.В. Карамышева, Т.А.Гайнер. Современные методы молекулярно-цитогенетического анализа и
диагностика хромосомных патологий.//Геномика-медицине.2005

по интерфазным ядрам
выявить и уточнить выявленный хромосомный мозаицизм
уточнить

точки разрывов при структурных перестройках хромосом
установить природу добавочного хромосомного материала и маркерных хромосом
выявить микроперестройки хромосом (при предполагаемом диагнозе)

нельзя
провести полное исследование всех хромосом набора (анализируется конкретный локус конкретной хромосомы)

проводить молекулярный анализ анеуплоидий на некультивируемых эмбриональных клетках.

Принцип

КФ-ПЦР основан на анализе высокополиморфных коротких тандемных повторов - STR-маркеров (гипервариабельных последовательностей в геноме длиной 2-7 пар оснований), определенных для каждой хромосомы.

Число аллелей может быть определено с использованием флуоресцентно меченых хромосом-специфичных праймеров для каждого из STR маркеров.

21 у плода с трисомией 21 (синдромом Дауна)
D21S1437
D21S11
D13S634
D18S535
D18S391
D13S742

D18S386
D21S226
D18S380
D21S1411
D13S628

диагностики
преимущества
возможность анализа некультивированных клеток
скорость и производительность
При кариотипировании лимфоцитов

- 45,X/46,X,i(X)(q10)/47,X,i(X)(q10),i(X)(q10)

недостатки (объективные)
Селективный анализа индивидуальных хромосом. На основании определения числа копий отдельных участков нескольких хромосом заключение о кариотипе (числе и структуре всего хромосомного набора) некорректно.
Остаются проблемы анализа малопроцентного мозаицизма.
Не решается проблема структурных перестроек хромосом.

по результатам QF-PCR – 47,XXX

структурных перестроек хромосом и анеуплоидий по целым хромосомам.
Разрешающая

способность метода позволяет идентифицировать микроделеции и микродупликации, невидимые при стандартном кариотипировании

Показания:
Идиопатическая задержка умственного и физического развития у ребенка
МВПР у плода

Author 2010. Published by Oxford University Press on behalf

of the European Society of Human Reproduction and Embryology. All rights reserved. For Permissions, please email: journals.permissions@oup.com

Результаты сравнительной геномной гибридизации ДНК клеток бластоцисты (зеленое мечение) с референсной ДНК 46,XY (красное мечение). Результат верифицирован методом FISH

Сравнительная геномная гибридизация

цитологических препаратов, использовать клетки разных тканей
в отличие от

FISH и QF-PCR в одном эксперименте провести анализ числа всех хромосом и выявить несбалансированные микроперестройки по всему геному (в зависимости от плотности покрытия хромосом на матрице)

Нельзя:
выявить сбалансированные структурные перестройки!
выявить низкоклональный мозаицизм (менее 10%)

секвенирование