Слайд 2
План:
Определение компетентности
Химические методы
Физические методы
Слайд 3
Определение
Компетентностью при генетической трансформации обычно называется способность бактериальных
клеток адсорбировать и поглощать чужеродную ДНК.
У многих видов бактерий
компетентность возникает лишь на определенном этапе роста культуры.
Например, культуры стафилококков находятся в стадии компетентности в ранней логарифмической фазе роста.
Культуры бактерий Bacillus subtilis находятся в стадии компетентности
на более поздних этапах экспоненциального роста,
гемофильные бактерии – в стационарной фазе роста.
У некоторых бактерий клетки компетентны в любой фазе роста (например, у гонококков и менингококков).
Установлено, что в компетентных культурах стрептококков, гемофильных бактерий к трансформации способна почти каждая клетка. В то же время у B. subtilis в этих же условиях ДНК могут поглощать только 10–15 % клеток популяции, у Aspergillus niger – 0,1–0,2 %, у Rhizobium japonicum – до 0,1 % клеток всей популяции.
Слайд 4
Определение
В ряде научных лабораторий было показано, что состояние
компетентности можно
передать от компетентных клеток некомпетентным посредством фильтратов суспензий
бактериальных культур, следовательно существует какой-то
внеклеточный фактор, обеспечивающий состояние компетентности.
Хотя естественная трансформация описана более чем у 50 видов бактерий, факторы компетентности известны лишь у стрептококков и бацилл. Возможно, что у некоторых видов они еще просто не обнаружены;
однако можно считать установленным, что трансформация у таких хорошо изученных микроорганизмов, как гонококки и менингококки, осуществляется без факторов. Это вполне объяснимо, так как клетки гонококков и менингококков способны к трансформации в любой стадии роста культуры: компетентность является их постоянным свойством.
Слайд 5
Определение
Компетентные клетки у различных видов бактерий отличаются от
некомпетентных не только способностью к поглощению ДНК, но и
другими свойствами:
• обладают сниженным уровнем метаболизма;
• более устойчивы к пенициллину, чем остальные клетки в популяции;
• сниженным темпом репликации ДНК или вообще ее отсутствием;
• меньшими размерами, чем некомпетентные;
• изменением наружных слоев, наличием обнаженных участков цитоплазматической мембраны;
• повышенной чувствительностью к осмотическому шоку, тепловой
обработке;
• сниженным поверхностным зарядом.
Однако существует много видов бактерий, у которых отсутствует естественная компетентность. Примером таких бактерий являются E. coli,
бактерии рода Erwinia и другие, но несмотря на это, они также могут
быть трансформированы.
Слайд 6
Химические методы
Клетки Е. соli не обладают природной компетентностью.
Однако ввиду важности этого организма для молекулярной генетики, были разработаны методы,
позволяющие придавать им искусственную компетентность, выращивая клетки в специальных минимальных питательных средах, содержащих глюкозу в качестве источника углерода. Наибольшую известность приобрел метод индукции компетентности с помощью ионов кальция – кальциевый метод. Клетки бактерий выдерживают в присутствии ионов Са2+ (50 мМ) при 0 ºС с последующим кратковременным тепловым воздействием при 37 ºС или 42 ºС. Эффективность трансформации повышается при совместном действии ионов Са2+ с ионами Mg2+, Mn2+ или Rb+. Кроме того, эффективность трансформации повышается при увеличении времени инкубирования с
ионами Ca2+, а также при добавлении диметилсульфоксида. Ионы Mg2+ необходимы для активации специфических нуклеаз, участвующих в захвате экзогенной ДНК.
Слайд 7
Физические методы
Широко используется также способ индукции компетентности за
счет
глубокого замораживания с последующим оттаиванием клеток. При этом осуществляется
трансформация как хромосомной, так и плазмидной ДНК. Такой способ трансформации получил название криотрансформации. Чтобы получить трансформанты с помощью этого метода, смесь реципиентных клеток и ДНК донора в присутствии криопротектора
(0,5 % раствора твина-80) замораживают (до –196 ºС), а затем отогревают при +42 ºС и высевают на селективные среды, позволяющие отобрать трансформанты.
Слайд 8
Физические методы
Механизмы индукции компетентности изучены недостаточно. Показано, что
высокие концентрации ионов кальция и других щелочно-земельных металлов вызывают
структурную реорганизацию клеточных мембран, а также плазмолиз. В мембранах обнаруживаются полиморфные структурные изменения, образуются участки соединения и слияния
мембран. При этом усиливается мембранная проницаемость, увеличиваются размеры периплазматического пространства. В связи с этим предполагается, что ДНК поступает в цитоплазму за счет дефектов в мембранах, а также в участках их слияния.
Возможно, что аналогичные изменения возникают в клетках и под влиянием других воздействий, индуцирующих компетентность. Высказывается предположение, что в процессе замораживания-оттаивания молекулы ДНК поступают в цитоплазму путем диффузии через временные быстро репарируемые дефекты мембран.
