Презентация на тему по гистологии по теме Гистотехника

материала (секционного, биопсийного, экспериментального)
Рабочая комната для лаборантов
Аппаратурная
Моечная

парафин
Тканевый гистологический процессор закрытого типа

патогистологической лаборатории эффективно использовать рабочее время и облегчает работу

с архивным материалом.

К документации, ведение которой является обязательным, относятся:
алфавитный журнал для регистрации биопсийного и операционного материала;
журнал регистрации выдачи биопсийного;
журнал регистрации секционного материала;
направления на патогистологическое исследование.

У старшего лаборанта должны быть:
книги учета спирта,
книга учета медикаментов
книга учета химических реактивов, по которому легко находят нужный для работы реактив.

срезов;

окрашивание;

заключение срезов.

сохранения при доставке
Адекватная фиксация
Виды гистологического материала:

Прижизненный (биопсийный) материал
2.

Трупный (аутопсийный) материал.

оперативном лечении всего патологического образования, или органа;

инцизионная – иссечение

части патологического образования или органа;

пункционная – забор материала для исследования путем прокола органа или ткани иглой;

аспирационная – забор материала тонкой иглой путем отсасывания из органов и образований, имеющих полости, заполненные содержимым;

трепан-биопсия – при помощи специальной толстой иглы этим способом проводится забор костных материалов;

щипцевая – материал собирается «скусыванием» из органов и тканей (при гастросокпии, колоноскопии и т.д.);

путем кюретажа – внутренних стенок (матки, полостей).

мм (секционный материал может быть объемнее)
Вырезанный кусочек погружают сразу

в фиксатор (операционный материал сразу помещают в бюкс, смачивают поверхность физ. раствором и срочно доставляют в лабораторию)
Маркировка (этикетка) сопроводительная в бюксе или в фиксаторе.
Кусочки вырезают на границе нормальной и измененной ткани
Сосуды сворачивают в трубочку «рулон»
Полые органы (кишечник, желчный пузырь, вена и др.) в ванночке с фиксатором фиксируют булавками
Легкие погружают в фиксатор с «грузилом»
Кусочки органов вырезают только острым ножом или бритвой
Нельзя сдавливать кусочки, скоблить или протирать их поверхность
Головной мозг из области черепа извлекают очень аккуратно, без давления на те области, которые необходимы для гистологического исследования
Недопустимо обмывание кусочков водой перед фиксацией, если отмыть материал от крови используют изотонический раствор хлорида натрия или раствор Рингера.

стабилизацию тканевых структур и их уплотнение.
Под действием фиксатора

в тканях и органах происходят сложные физико-химические изменения. Наиболее существенным из них является процесс необратимой коагуляции белков, вследствие которого жизнедеятельность прекращается, а структуры становятся мертвыми, фиксированными. Фиксация приводит к уплотнению и уменьшению объема кусочков, а также к улучшению последующей окраски клеток и тканей. Выбор фиксатора зависит от задачи исследования (например, при выявлении гликогена объекты фиксируются в этаноле, а не в формалине).

погружают в фиксатор, либо подвергают термической обработке.
Толщина кусочков не

должна превышать 4-5мм.
Объем фиксирующей жидкости должен превышать объем кусочков не менее чем в 10 раз.
Кусочки в фиксаторе не должны слипаться и прилипать ко дну емкости (фильтровальная бумага на дно, повесить объект на нитке)
При фиксации в формалине не желательно охлаждение, т.к. замедляется проникновение фиксатора в ткани.
Проводят фиксацию обычно при комнатной температуре.

оболочки (мозговые, серозные) перед фиксацией надо растянуть и закрепить

нитками на картоне, пробке или тонкой дощечке.
Кусочки легкого помещают в фиксатор завернув его в марлю с грузиком.
Фиксатор не используют повторно.

При завершении фиксации ткань имеет равномерную окраску и одинаковую

консистенцию на поверхности разреза.

требуют работы в вытяжном шкафу!

хорошо проникает в ткани и может применяться для фиксации

крупных объектов, подходит для консервации органов.)
В чистом виде представляет 40% раствор формальдегида. Применяется в виде 10-20% водного раствора. Ткани пропитываются формалином со скоростью до 1мм/ч (при толщине не более 0,5см). Время фиксации формалином не меньше 24 часов при комнатной температуре для объектов толщиной от 1 мм до 5 мм, а для объектов 5-7 мм - 48-72 часа
Хранение формалина в темной плотно закрывающейся стеклянной посуде при температуре не ниже 9 градусов.
Формалин сильно раздражает слизистые! Работа в перчатках!
Чаще материал в лабораторию приходит уже в формалине. Но материал заливается свежей порцией формалина.

проницаемой способностью, чем формалин (кусочки не более 0,5см). Пригоден

для гистохимических исследований.
Под кусочки ткани обязательно слой ваты.
Время фиксации: для тонких пленок 15-30 мин., для кусочков толщиной 3-4мм – 2-4 часа.

всех тканей кроме ткани почки)
жидкость Карнуа (применяется при быстрой

фиксации и ускоренной проводки – хорошо сохраняет структуру ядра клетки)
этанол – уксусная кислота и метанол – уксусная кислота (для объектов, в которых планируется выявлять аргентофильные белки ядрышкового организатора)
Фиксаторы, содержащие сулему: В5, жидкость Ценкера, Максимова, Гелли и «Суза» Гейденгайна

полной фиксации ткани, при этом необходима тщательная промывка материала

1-3 часа в слабощелочных растворах.
Объем декальцинирующей жидкости должен превышать объем объекта в 10-20 раз.
Твердые компоненты, имеющиеся в ткани (кость, хитин, отложения извести и др.), размягчают воздействием кислот или с помощью постоянного электрического тока — так называемая электролитическая декальцинация и после удаления из ткани кислоты приступают к изготовлению препаратов.

нагрев, так и охлаждение приводит к повреждению тканей. Ткани

не фиксированные не следует охлаждать и тем более, замораживать. Медленно замерзая в клетках, начинают образовываться кристаллы воды, которые рвут стенки клеток.
Высушивание ткани. Не стоит откладывать фиксацию после операции или аутопсии. Поскольку на воздухе материал высыхает, обветривается и начинает разлагаться.

коричневых чётко очерченных гранул. Это происходит в органах, которые

насыщенны кровью.

другим процедурам приготовления препаратов или образуют осадки, поэтому должны

быть удалены из материала. Промывание обычно проводят в дистиллированной воде или в фосфатных буферах с определенными значениями рН. Промывают в проточной воде до 24 ч и подсушивают на фильтровальной бумаге.

к пропитке с последующей резкой на различных микротомах.
Используют батарею

спиртов восходящей концентрации, начинающейся с 50-80% этанола до абсолютного этанола (ацетон, изопропанол, диоксан). Нельзя сразу после промывки помещать материал в 96% спирт.
Продолжительность пребывания объектов обусловлена размерами кусочков и задачами исследования. Продолжительность процесса обезвоживания в спиртах в среднем 48 ч.
При обезвоживании по спиртовой батарее вручную их осторожно промокают фильтровальной бумагой или салфеткой из марли, что позволяет реже менять спирты в батарее.
Спирты не должны быть мутными. Нельзя долго повторно использовать.

все же остается мягким и нежным. Из такого материала

сделать тонкие срезы невозможно. Поэтому его необходимо пропитать затвердевающими веществами.
Фиксированную ткань обезвоживают и пропитывают одним из этих веществ, проводя ее через промежуточный растворитель.

может быть в:
Парафин
Целлоидин
Желатин
Пропитку парафином проводят в термостате с температурой

58°С.
Все более широкое применение находят для заливки тканей синтетические смолы (аралдит, эпон и другие), особенно при изготовлении срезов для электронной микроскопии.

(от 5—8 мкм и до 1—2 мкм).
Можно сделать

серии срезов
Быстрая заливка
Действие высокой температуры
Нужно удалять его из среза

Срезы легко режутся на микротоме и хорошо окрашиваются большинством красителей
Толщина их больше, чем у парафиновых срезов
Не нужно удалять его из среза
Нет воздействия высокой температуры на срез
Длительность заливки
Трудно сделать серии срезов

ряд растворов:
смесь 100 % спирта и ксилола (1

: 1)
ксилол (две порции)
смесь ксилола с парафином (1:1, при t° 37°)
в чистый парафин (две порции, при t° 55—56°).
Парафин быстро охлаждают, кусочек ткани с окружающим его парафином вырезают в виде так называемого блока.

специальных приборах — микротомах. В гистологической технике чаще всего употребляются

микротомы, которые делятся на санные, ротационные и замораживающие.

Требования к изготовлению среза:

Получение тонких (5-6 мкм) срезов
Получение серийный срезов
Использование одноразовых лезвий или лезвий без дефектов
Срезы с ножа снимать препаровальными иглами
После снятия срезы помещают в водяную баню для расправления
Помещают срезы на воду (предметное стекло) обязательно поверхностью, прилежащей к ножу, определить которую можно по характерному блеску (верхняя сторона всегда матовая)
Монтировка среза на стекло под углом 45°
После расправления среза на стекле аккуратно удалить излишки воды фильтровальной бумагой
Высушить монтированные срезы на гистологическом столике с температурой 37°С
Перед наклеиванием срезов предметные стекла должны быть подготовлены (обезжирены) и быть обработаны специальными адгезивными средствами.

и для постановки гистохимических реакций.


Депарафинирование осуществляют в гистологических стаканчиках

(бюксах) или стеклянных кюветах с пазами для стёкол с плотно притёртыми крышками.

Схема депарафинирования:
Ксилол I
Ксилол II
Абсолютный этанол
95% этанол
70 % этанол
Вода дистиллированная

После каждой кюветы стекло промокать фильтровальной бумагой.

солями металлов (в электронной микроскопии) применяют для увеличения контрастности

изображения отдельных структур при рассматривании их в микроскопе.

кармин
Сафранин
Азур-2-эозин
Железный гематоксилин-пикрофуксин по Ван-Гизону
Специальные методы окраски для изучения

структур клеточного ядра
Методы окраски соединительной ткани
Методы окраски нервной ткани
Методы окраски костной ткани
Выявление включений амилоида
Выявление металлов
Выявление гемоглобинсодержащих пигментов
Выявление нейтрального жира
Выявление углеводов

идет до тех пор, пока не достигается интенсивное проникновение

красителя в ткань. То есть время подбирается четко, без перекрашивания.
Регрессивное основано на первоначальном перекрашивании с последующей дифференцировкой до нужного уровня окраски. Время окрашивания зависит от концентрации красителей. Дифференцирование срезов в солянокислом спирте.

Окраска

прогрессивная

регрессивная

в течение длительного времени красителями низкой концентрации достигается лучшие

результаты, чем при окраске в течение короткого времени красителями высокой концентрации
Более четкая окраска достигается регрессивным методом с дифференцировкой
После дифференцировки (под микроскопом)необходимо тщательно отмыть срез иначе дифференцирующее вещество быстро обесцветит препарат.

- наиболее распространенный метод окрашивания срезов.

Эта окраска является

двойной: гематоксилин - основной краситель - окрашивает ядра клеток (фиолетовый цвет), эозин - кислый краситель - красит цитоплазму клеток (розовый цвет) и в меньшей степени - различные неклеточные структуры.

Гематоксилин представляет собой экстракт древесины кампешевого дерева, произрастающего в Америке.

Эозин - искусственная краска.

Растворы красителей должны быть приготовлены заранее.

Гематоксилин сам по себе не является красящим веществом. Для того чтобы приготовить краску, гематоксилин подвергают окислению, в результате чего он превращается в красящее вещество - гематеин. В соединении с некоторыми солями гематеин дает четкое окрашивание ядер.

четко контурируются)

для преломления света при микроскопии.

После окраски проводят дегидратацию препаратов

проводя их через серию спиртов возрастающей концентрации:

70% этанол
80% этанол
95% этанол
100% этанол (бутанол)
Ксилол 1
Ксилол 2

получение пригодных для микроскопии и хранения препаратов.



Нанести на предметное

стекло каплю Канадского бальзама и приставить к ней ребром покровное стекло.
Препаровальной иглой осторожно опустить покровное стекло.
Препаровальными иглами выжать пузырьки воздуха из под покровного стекла.
Следить за достаточным количеством бальзама под покровными стеклами.
Сушить препараты в термостате при 37°С (до суток и более), можно при комнатной температуре.

дистиллированную воду
Окрашивание срезов гематоксилином (время подбирается индивидуально)
Споласкиваем в дистиллированной

воде
Погружаем в проточную воду до посинения – 30 мин
Дифференцирование срезов (1-2сек) в солянокислом спирте
Споласкиваем дистиллированной водой для прекращения дифференцировки
Опускаем в проточную воду до посинения
Производим контроль качества дифференцировки под микроскопом.
Споласкиваем срезы дистиллированной водой
Докрашиваем срезы эозином (15-20 сек)
Споласкиваем 96 градусным спиртом (70 градусным, если срезы слишком яркие)
Обезвоживаем срезы в спиртах возрастающей концентрации
Просветляем срезы в 2 порциях ксилола
Заключаем в канадский бальзам

способу микроскопии:
Световая — просвечивание в видимой части спектра.
Фазово-контрастная,

позволяющая изучать клетки без окрашивания. Разновидностью этого метода является темнопольная микроскопия, дающая негативное изображение.
Интерференционная микроскопия, которая дает возможность определять концентрацию вещества в клетке и проводить количественные морфологические измерения.
Поляризационная, позволяющая определять характер расположения молекул в клетке.
Люминесцентная (флуоресцентная), при которой клетки окрашиваются специальными красителями, заставляющими их светиться во флуоресцентном освещении.
Ультрафиолетовая — просвечивание в ультрафиолетовой части спектра.
Электронная, при которой для просвечивания используется не свет, а направленный пучок электронов.
Радиоавтография — исследование, предполагающее использование изотопных меток, позволяет оценить скорость обменных процессов в клетке.
Цитоспектрофотометрия — изучение химического состава клетки.

следующие материалы:
- Направления;
- Протоколы;
- Журналы;
- микропрепараты;

- тканевые образцы в парафиновых блоках;
- тканевые образцы в 10%-ном растворе нейтрального формалина;
- материалы, полученные по результатам патолого-анатомических вскрытий, указанные в пункте 34 порядка проведения патолого-анатомических вскрытий, утвержденного приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации от 6 июня 2013 г. № 354н.

(операционных) материалов и документов, оформленных в рамках патолого-анатомических исследований:

тканевые образцы в 10%-ном растворе нейтрального формалина при наличии опухолевого или опухолеподобного процесса — не менее одного года с даты оформления протокола, в прочих случаях - не менее чем до окончания оформления протокола;
микропрепараты и тканевые образцы в парафиновых блоках - в течение срока хранения медицинской документации пациента;
направления и протоколы — в течение срока хранения медицинской документации пациента.

копий направлений и протоколов (далее - архивные материалы) пациенту

либо его законному представителю фиксируется в журнале с указанием следующих сведений:

дата выдачи архивных материалов;
сведения о пациенте (фамилия, имя, отчество и дата рождения);
регистрационный номер патолого-анатомического исследования;
сведения о лице, которому выданы архивные материалы, и его подпись;
сведения о работнике, который произвел выдачу архивных материалов, и его подпись;
отметка о возврате ранее выданных микропрепаратов, тканевых образцов в парафиновых блоках в архив патолого-анатомического бюро (отделения).

вскрытий хранятся постоянно (бессрочно).
Журнал учета приема и выдачи

трупов патологоанатомической организации (подразделения); валовая и алфавитная книги (журналы) патологоанатомических вскрытий; хранятся постоянно (бессрочно).
Корешки бланков медицинских (врачебных) свидетельств о смерти и журнал их учета хранятся 1 год после календарного года, в котором выдано свидетельство и уничтожаются комиссионно, с составлением акта в соответствии с действующими нормативными документами.
Прочая документация патологоанатомической организации (подразделения) хранится 3 года (уничтожается без составления акта), если иное не предусмотрено действующими нормативными документами.

класса Б :
влажный архив или нефиксированный материал после биопсийных

и аутопсийных исследований,
гистологические препараты и блоки, подлежащие уничтожению после временного хранения,
материалы и инструменты.

1. Дезинфекция отходов классов Б и В производится в соответствии с действующими нормативными документами.
Дезинфекция производится в пределах медицинского подразделения, где образуются отходы данного класса.
 
2. Все отходы, класса Б после дезинфекции (если они не были фиксированы в формалине и других фиксирующих жидкостях) собираются в одноразовую герметичную упаковку. Гистологические препараты (стекла), иглы, ножи и др. (после дезинфекции) собираются в отдельную одноразовую твердую тару.

3. Герметичная одноразовая тара с отходами класса Б в дальнейшем утилизируется путем кремации (термическое обезвреживание). Твердые острые предметы (гистологические препараты) утилизируются централизованно, после дезинфекции вывозятся на полигон твердых бытовых отходов.

архив (в 10% нейтральном формалине) патологоанатомического вскрытия может быть

уничтожен по окончании гистологического исследования и установления патологоанатомического диагноза или сохранен по распоряжению врача-патологоанатома, производившего вскрытие или руководителя патологоанатомическим организациям (подразделением).
Гистологические препараты и парафиновые блоки материалов патологоанатомического вскрытия хранятся 3 года. Уничтожаются без составления акта.
Уничтожение (утилизация) биоматериалов – «влажного» архива, кусочков ткани после переплавки блоков и др., осуществляется в соответствии с действующими нормативными и распорядительными документами о порядке утилизации биологических отходов.
Выдача гистологических препаратов и парафиновых блоков материала патологоанатомических вскрытий производится только по письменным запросам и только медицинских организаций, правоохранительных органов с регистрацией в журнале выдачи.
Гистологические препараты и их блоки после изучения подлежат возврату в патологоанатомическую организацию (подразделение).

их результате.

1. Дефекты аналитического этапа :
Ошибки, допущенные при фиксации;
Некачественная

проводка;
Ошибки при заливке;
Дефекты микротомии;
Неадекватная окраска.

2. Артефакты постаналитического этапа:
Высыхание ;
Вода в срезе;
Выцветание препарата.