Презентация на тему Хромосомные аномалии в эмбриональных стволовых клетках человека hESM01-04

человека в процессе культивирования и определить характеристики, по которым

ЭСК с выявленными хромосомными перестройками отличаются от клеток исходных линий.

Слайд 2 из 17

человека четырёх линий – hESM01, hESM02, hESM03 и hESM04

– в процессе культивирования;

2) провести молекулярно-цитогенетический анализ состава и организации выявленных перестроенных хромосом;

3) получить и охарактеризовать дифференцированные клетки из ЭСК с нормальным кариотипом, а также из ЭСК, несущих выявленные аномальные хромосомы;

4) провести сравнительный анализ характеристик ЭСК исходных линий hESM01-04 и ЭСК, несущих аномальные хромосомы;

5) разработать метод одновременной визуализации и идентификации хромосомных территорий перестроенной хромосомы и её нормального гомолога в трёхмерном пространстве интерфазного ядра ЭСК, несущих выявленные аномальные хромосомы;

6)провести оценку влияния хромосомных перестроек на положение хромосом в интерфазных ядрах ЭСК, несущих выявленные аномальные хромосомы.

Слайд 3 из 17

иммуноокрашивания дифференцированных клеток с помощью антител против CD105 (a),

пролил-гидроксилазы (б);
ядра окрашены DAPI – синий цвет.

а б

Общий вид клеток

Слайд 4 из 17

46, XX, del(4),der(9)
r(18)
der(9)
9

Иммуноокрашивание клеток hESM01r18.
На фотографиях «а» и «б»

представлены фрагменты колоний.
а – Tra-1-60 – красный сигнал, ядра окрашены DAPI – синий цвет;
б – OCT4 – зелёный сигнал.

Сублиния hESM01r18. 46, ХХ, r(18)

del(4)

4

на M01r .
FISH микродиссекционной
ДНК пробы der(18) с хромосомами

клеток сублинии hESM01r18

FISH теломерной
ДНК пробы с хромосомами
клеток сублинии ESM01r18

der(18)

der(18)

Реорганизация хромосомы 18 в клетках сублинии ESM01r18

Слайд 6 из 17

микродиссекционной ДНК пробы der(18) c метафазными хромосомами лимфоцитов взрослого

человека с нормальным кариотипом

18(p11.31q21.2)

Реорганизация хромосомы 18 в клетках сублинии ESM01r18

Слайд 7 из 17

внимательное рассмотрение
FISH микродиссекционной ДНК пробы der(18) с хромосомами
клеток

сублинии hESM01r18

Реорганизация хромосомы 18 в клетках сублинии hESM01r18

Слайд 8 из 17

хромосомами клеток сублинии hESM03der9;
б - с хромосомами лимфоцитов здорового

донора (фрагмент пластинки).

der(9)

9

del(4)

4

del(4)(q25q31.1)

нормальной хромосомы 9 и der(9) для получения хромосомоспецифичных проб

WCP9 и WCPder(9), а также районоспецифичных проб PCPder(9)-p, PCPder(9)-1, PCPder(9)-2 и центромерной пробы PCPC

Схема микродиссекции хромосом 9 и её деривата

Слайд 10 из 17

WCPder(9) (красный цвет) и прицентромерной PCP9C (жёлтый цвет) микродиссекционных

ДНК проб с хромосомами клеток сублинии hESM03der9.

Пример гибридизации микродисс проб из материала хромосом 9 и её деривата на дериватные хромосомы

Слайд 11 из 17

приготовленной на базе клонированного фрагмента ДНК из района делеции.

Оптические срезы двух ядер (три проекции).

Совместная 3D FISH ДНК пробы, маркирующей нормальный гомолог хромосомы 18, и хромосомоспецифичной пробы WCP18, окрашивающей хромосомные территории хромосомы 18 и её деривата. Ядра окрашены DAPI – синий цвет.

Визуализация и идентификация хромосомных территорий хромосомы 18 и её деривата

в ядрах клеток hESM01r18
Совместная 3D FISH ДНК пробы, маркирующей

нормальный гомолог хромосомы 18, и хромосомоспецифичной пробы WCP18, окрашивающей хромосомные территории хромосомы 18 и её деривата. Ядра окрашены DAPI – синий цвет.

Серии оптических срезов.

Трёхмерная реконструкция хромосомных территорий хромосом 18 и r18 в ядрах клеток hESM01r18

клетках сублинии hESM01r18

пространстве интерфазного ядра клетки сублинии hESM03der9
3D FISH хромосомоспецифичной WCPder(9)

(зелёный цвет) и прицентромерной PCP9C (красный цвет) ДНК проб с ядрами ESM03der9.

der(9)

9

3D реконструкция хромосомы 9 и её деривата в пространстве интерфазного ядра клетки сублинии hESM03der9

в то же время показано, что при проведении регулярного

мониторинга состояния кариотипа возможно проведение длительного
культивирования клеток hESM01-04, не сопровождающееся тотальной
дестабилизацией кариотипа.

Детально охарактеризованы выявленные аномальные хромосомы, являвшиеся производными хромосом 4, 9 и 18, с помощью полученного комплекта микродиссекционных проб.

3) Показано, что, несмотря на сохранение «маркёров плюрипотентности», способности к дифференцировке ЭСК, отягощённых выявленными хромосомными аномалиями, снижены по сравнению с клетками исходных линий hESM01-04.

Выводы (первая часть)

Слайд 16 из 17

хромосомных территорий хромосомы 18 и её деривата в клетках

hESM01r18, хромосомы 9 и её деривата в клетках hESM03der9.

5) На примере хромосомных территорий хромосом r18 и её нормального гомолога показано, что хромосомная перестройка сопровождалась изменением локализации перестроенной хромосомы по сравнению с локализацией её нормального гомолога относительно периферической области ядра и ядрышек. На примере аномалии хромосомы 9 в клетках hESM03der9 и их дифференцированных производных показано, что дуплицированный район, содержащий последовательности, гомологичные прицентромерным повторам, локализуется предпочтительно в периферической области ядра, также как и прицентромерные районы хромосом 9 и её деривата.

Выводы (вторая часть)

Слайд 17 из 17

PCP9C (красный цвет) ДНК проб с ядрами hESM03der9.
3D реконструкция

хромосомы 9 и её деривата в пространстве интерфазного ядра клеток сублинии hESM03der9

Здесь лучше видны районы хромосом 9 и её деривата в пространстве, показано как исключить дапийный канал

прицентромерный район хромосомы 9,
9С – прицентромерный район хромосомы der(9),
dup9

– дополнительный сигнал на хромосоме der(9).
Хромосомы окрашены красным, сигналы жёлтым.

Один из вариантов локализации районов dup9, 9С и 9N в ядрах клеток hESM03der9 и в ядрах дифференцированных клеток, полученных на основе hESM03der9.

Локализация трёх районов хромосомных территорий хромосом 9 и der(9) в клетках hESM03der9 и их дифференцированных производных

Один из вариантов локализации районов dup9, 9С и 9N в ядрах клеток hESM03der9 и в ядрах дифф клеток, полученных на основе hESM03der9. И обозначение районов dup9, 9N, 9C.

и ядрышка.
(С 1) – одной стороной лежит в периферической

области ядра;
(С 2) – двумя сторонами лежит в периферической области ядра;
(C nu) – касается ядрышка,
(С 1 + nu) – одной стороной касается ядрышка, другая лежит в периферической области ядра;
0 - не касается ядрышка и не лежит в периферической области ядра.
Зелёным обозначены варианты локализации части хромосомной территории, красным – ядрышки.

Схема: как мы анализировали положение районов девятых хромосом.

клеток. Линия hESM01
Срезы эмбриоидных телец. Линия hESM03
Oct-4
АР
Moc-31
СD 105
Десмин
α-фетопротеин
Пример иммуноокрашивания

нормальных ЭСК на маркёры плюрипотентности и эмбриоидных телец из них на тканеспецифические маркёры

дифф в эмбриоидные тельца дериватных клеток

и hESM03der9
Сравнение скорости роста клеток дериватных и исходных

сублиний

XX, del(4),der(9)
r(18)
der(9)
9
del(4)
4
Сублиния hESM01r18. 46, ХХ, r(18)
Слайд 5 из 17