Презентация на тему Серологические реакции

реакции взаимодействия между антигеном и соответствующим ему специфическим антителом

in vitro, имеющие различные внешние проявления.
Широко используются в микробиологических и серологических лабораториях с целью:
серодиагностики бактериальных, вирусных, реже других инфекционных заболеваний,
сероидентификации выделенных бактериальных, вирусных и других культур различных микроорганизмов

известного антигена – диагностикума
обнаружение неизвестных антигенов с помощью известных

антител.
Для серологической идентификации возбудителя – определение серогруппы, серовара возбудителя с помощью специфической иммунной диагностической сыворотки

антигена и антитела за счет водородных, кулоновских и вандерваальсовых

сил.

Неспецифическая (видимая, медленная, необратимая) – появление видимых изменений: агглютинации, гемолиза и т.д.

антигенов, которая определяется с помощью данной реакции.

Специфичность - способность

антигенов или антител реагировать только с гомологичными антителами, содержащимися в сыворотке крови, либо с гомологичными антигенами соответственно.

Реакции агглютинации и преципитации
Наиболее полно механизм соединения антигена и

антитела объяснен гипотезой Маррека (теория "решетки") и Полинга (теория "фермы") .

Маррек рассматривает соединение антигена и антител в виде решетки, в которой антиген чередуется с антителом, образуя решетчатые конгломераты.

Согласно гипотизе Полинга антитела имеют две валентности (две специфические детерминанты), а антиген несколько валентностей - он поливалентен. При соединении антигена и антител образуются агломераты, напоминающие "фермы" построек.

антител образуются большие прочные комплексы, видимые простым глазом.

При

избытке антигена каждый активный центр антител заполнен молекулой антигена, не хватает антител для соединения с другими молекулами антигена и образуются мелкие, невидимые глазом комплексы.

При избытке антител, для образования решетки не хватает антигена, детерминанты антител отсутствуют и видимого проявления реакции нет.

антигенов (бактерий, эритроцитов) путем их склеивания антителами с образованием

аггломератов – хлопьев, в присутствии электролита NaCl.

РА используют для:
Серотипирования выделенной чистой культуры возбудителя
Экспресс-обнаружения возбудителя
обнаружения антител в сыворотке крови больного животного

клетка (бактерия или эритроцит)
Антитело – IgM (валентность 5)
Физраствор

Агглютинация с

О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие O- антиген) происходит в виде мелкозернистой агглютинации.
Агглютинация с Н - диагностикумом (бактерии, убитые формалином,сохранившие жгутиковый Н-антиген) - крупнохлопчатая и протекает быстрее.


Способы постановки: РА на стекле; развернутая
РА

выделенной чистой культуры возбудителя, реже для ускоренного обнаружения антител

Постановка

реакции:
На предметное стекло помещают каплю сыворотки (Опыт) и каплю физраствора (Контроль)
В каждой капле распределяют взвесь бактерий
Появление мелкозернистой или хлопьевидной агглютинации – положительный результат
Равномерное помутнение – отрицательный результат

Опыт «+» Контроль «-»

в сыворотке больного

Постановка реакции:
Развернутую РА проводят в пробирках или

лунках пластин.
При этом готовят десятикратные разведения исследуемой сыворотки и вносят одинаковые количества антигена.
При положительном результате на дне пробирки образуется рыхлый осадок и сам раствор становится прозрачным,
отрицательный результат- помутнение раствора сохраняется

«+» «-»

антигенов и антител, который основан на способности корпускулярных носителей(

эритроцитов, шариков латекса, клеток стафилококков) адсорбировать на своей поверхности растворимые антигены.
- В зависимости от типа
корпускулярного носителя различают:
РНГА
Латекс-агглютинация
РКоА

диагностикум
(эритроциты с адсорбированными на
них антигенами)
2. Исследуемая сыворотка
3.

Физраствор

 РНГА ставят в пластиковых планшетках с разведениями сыворотки крови больного, к которым добавляют эритроцитарный диагностикум.

Титр сыворотки= 1:160 (максимальное разведение исследуемого материала, при котором реакция положительна)

антительный диагностикум
(эритроциты с адсорбированными на
них антителами
2. Исследуемый

материал
3. Физраствор

 Постановка РОНГА не отличается от РНГА
Применение: обнаружение аг (например, бактериального экзотоксина)

с адсорбированными на них молекулами антигенов или антител агглютинируются

соответствующими антигенами или антителами. Применяют качественный и количественный методы. Ставят по типу агглютинации на стекле.

антитело

Латексные частицы, покрытые антигенами

praecipilo осаждать) - это формирование и осаждение комплекса растворимого

молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом.
Компоненты реакции:
Антиген – мелкодисперсный, растворимый
Антитело – IgG (валентность 2)
Физраствор

Преципитат образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах, избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса.

Реакцию преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др.

Широкое распространение получили разновидности реакции преципитации в полужидком геле агара или агарозы двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиапьная иммунодиффузия, иммуноэпектрофорез и др.

на иммунную сыворотку наслаивают растворимый антиген.

При оптимальном соотношении

антигена и антител на границе этих двух растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата.

Если в качестве антигенов в реакции используют прокипяченные и профильтрованные экстракты тканей, то такая реакция называется реакцией-термопреципитации (реакция, при которой выявляют сибиреязвенный гаптен).

Опыт Контроль

растопленный агаровый гель тонким слоем выливают на стеклянную пластинку

и после затвердевания в нем вырезают лунки.
В лунки геля раздельно помещают антигены и иммунные сыворотки, которые диффундируют навстречу друг другу.
В месте встречи в эквивалентных соотношениях они образуют преципитат в виде белой полосы.

Двойная радиальная иммунодиффузия представляет собой прежде всего метод количественного анализа. Ее применяют для определения количества антигена в жидкостях (сыворотка крови, цереброспинальная жидкость, экстракты тканей). Ее также применяют для проверки чистоты препаратов, при получении антисывороток животных и оценке эффективности иммунизации. 

У многокомпонентных систем между лунками с антигенами и антителами появляется несколько линий преципитата; у идентичных АГ линии преципитата сливаются; у неидентичных АГ - пересекаются.

гелем равномерно наливают на стекло.
После застывания в геле

делают лунки, в которые помещают антиген в различных разведениях.
Антиген, диффундируя в гель, образует с антителами кольцевые зоны преципитации вокруг лунок.
Диаметр кольца преципитации пропорционален концентрации антигена.

Реакцию используют для определения в сыворотке крови иммуноглобулинов различных классов, компонентов системы комплемента и др.

Зависимость диаметра кольца преципитации от количества аг

геле с иммунодиффузией.
Принцип ИЭФ состоит в следующем:
Вначале проводят

электрофоретическое разделение белков в забуференном геле агара;
после разделения в канавку, которая идет в направлении миграции белков, вносят преципитирующую иммунную сыворотку.
АГ и АС диффундируют в геле навстречу друг другу, и в месте их взаимодействия возникают дугообразные линии преципитации, число, положение и форма которых дают представление о составе исходной смеси антигенов.

на способности специфических антител – антитоксинов подавлять биологическую активность

экзотоксинов бактерий при образовании комплекса аг-ат.

ат против токсина А
Исслед.материал+ ат против токсина В
Исслед.материал+ ат

против токсина Е

иммунитета;
внутрикожно вводят минимальное количество токсина:
При наличии антител против

дифтерийного токсина видимых изменений не будет
При отсутствии антитоксического имммунитета наблюдается воспалительная реакция

Реакция нейтрализации токсина in vivo

при смешивании в определенныхсоотношениях с анти­токсической сывороткой образовывать помутнение-

инициальную флоккуляцию
Механизм реакции флоккуляции аналогичен таковому реакции преципитации.
Применяется для титрования антитоксических сывороток и определения типа токсина
Специфическую активность или силу анатоксина определяют в реакции флоккуляции в так называемых единицах флоккуляции— (Lf) .
Силу антитоксической сыворотки выражают в международных антитоксических единицах – МЕ
Одна антигенная единица анатоксина обозначается Limes flocculationis (Lf — порог флоккуляции), это то количество анатоксина, которое вступает в реакцию флоккуляции с одной единицей антитоксина.
То есть, условие инициальной флоккуляции: nLF=n МЕ

Реакция нейтрализации токсина in vitro
Реакция флоккуляции

В данном опыте помутнение – инициальная флоккуляция – происходит в пробирке №3
Каждая пробирка содержит 2х20=40Lf токсина
Поскольку условие инициальной флоккуляции: nLF=n МЕ, то в данной пробирке 40 МЕ сыворотки
Если 0,4 мл сыворотки содержат 40МЕ, то 1мл- 100МЕ

токсигенными (продуцирующими экзотоксин) и нетоксигенными.
Образование экзотоксина зависит от

наличия в бактериях профага, несущего tox-ген, кодирующий образование экзотоксина.
При заболевании все изоляты тестируются на токсигенность — продукцию дифтерийного экзотоксина с помощью реакции преципитации в агаре
Главное преимущество – отсутствие необходимости выделения чистой культуры

Реакция нейтрализации токсина in vitro
Реакция преципитации в геле

РНГА, поставленной с целью обнаружения ботулотоксина.

Возбудитель ботулизма - Clostridium

botulinum вырабатывает токсины семи сероваров (А, B, C, D, E, F, G), однако чаще других встречаются серовары А, В, Е.

Все токсины отличаются по антигенным свойствам и могут быть дифференцированы в реакциях типоспецифическими сыворотками.

Для этой цели можно поставить реакцию пассивной (непрямой) гемагглютинации с сывороткой больного, в которой предполагается наличие токсина, и эритроцитами, нагруженными антителами антитоксических противоботулинических сывороток типов А, В, Е.

Контролем служит нормальная сыворотка.

Учет.
В положительном случае эритроциты оседают на дне лунки в виде ровного слоя клеток со складчатым или зазубренным краем (зонтик), в отрицательном - оседают в виде пуговки или колечка.

Вывод: В сыворотке больного обнаружен ботулотоксин тип Е.

применяют антительный эритроцитарный диагностикум - эритроциты, на которых адсорбированы антитела. Антиген

–дифтерийный токсин

«+» «-»

быстро выявить неизвестный антиген.

Компоненты реакции:
Эритроцитарный диагностикум с дифтерийным анатоксином

Стандартная противодифтерийная сыворотка (антитела против дифтерийного токсина)

Исследуемая сыворотка ?
Принцип метода




Результаты:



При отсутствии антигена в исследуемой сыворотке
диагностикум взаимодействует со стандартной сывороткой и наблюдаем гемагглютинацию
При наличии антигена в исследуемой сыворотке антитела в нашей диагностической сыворотке будут нейтрализованы и агглютинации эритроцитов не будет

+

?

(

)

+

«-» «+»

том, что при взаимодействии специфических антител с антигенами клеток

(эритроцитов, бактерий), на их поверхности образуется комплекс антиген-антитело, который активирует комплемент по классическому пути, вследствие чего наступает лизис этих клеток.

иммунной сыворотке в присутствии специфических антител-бактериолизинов и комплемента лизис

бактерий идет существенно интенсивнее

Под воздействием бактериолизинов в присутствии комплемента микробы теряют подвижность, меняют форму (набухают), распадаются и, наконец, совсем растворяются.
Реакция бактериолиза применяется с целью идентификации холерных вибрионов (р. иммобилизации вибрионов холерными сыворотками) и определения вибриолизинов в сыворотке; при сифилисе (р. иммобилизации трепонем), при лептоспирозе (р. агглютинации-лизиса).

происходит только в присутствии аг (эритроциты барана), соответствующих антител

и комплемента
В отсутствии одного из ингредиентов гемолиза не наблюдается

В ней участвуют комплемент и две системы антиген -

антитело. 
Первая система – специфическая :антиген, антитело (испытуемая сыворотка) и комплемент (сыворотка морских свинок)
Вторая система – неспецифическая индикаторная – гемолитическая (эритроциты барана с гемолитической сывороткой, лишенной собственной активности комплемента).

1-я фаза - инкубация смеси, содержащей антиген + антитело

+ комплемент, 2-я фаза (индикаторная) - выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним.

При соответствии друг другу антигенов и антител они образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), таким образом происходит связывание комплемента комплексом антиген - антитело, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет (реакция положительная)

Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит - антиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз (реакция отрицательная).

-

+

разведении 1:10 равен 0,15 мл.

В опыте активность комплемента

может снизиться за счет неспецифической адсорбции его другими компонентами реакции, поэтому для опыта количество комплемента увеличивают: берут следующую за титром дозу. Это - рабочая доза.

В приведенном примере она равна 0,2 мл комплемента в разведении 1:10.

Для приготовления гемолитической системы смешивают равные объемы гемолитической сыворотки и взвеси эритроцитов.

Так как все компоненты, участвующие в РСК, должны быть взяты в равных объемах (в нашем примере он равен 0:5 мл), необходимо к рабочей дозе комплемента (0,2 мл 1:10) добавить 0,3 мл изотонического раствора

1:320 К1 К2 К3

К4

Специфическая система:
Антитела (сыворотка в различных разведениях). 
Антиген - диагностикум
Комплемент по 0,5 мл
Смешивают, инкубируют 60 минут при 37°С. 

Индикаторная система Добавляют по 2 мл гемолитической системы (ГС)
Смешивают, инкубируют 30 минут при 37°С. 
Учитывают результаты реакции.

К1 – контроль сыворотки (сыворотка + комплемент+ГС
К2 – контроль антигена (антиген+комплемент+ГС)
К3- контроль гемолитической системы (2мл ГС+физраствор)
К4 – контроль комплемента (2 мл ГС+ 0,5мл комплемента)

В нашем примере результат положительный.
Титр сыворотки 1:80

сыворотке, взятой через 5 дней после первого исследования титр

выше, что свидетельствует о развитии иммунного ответа на данный антиген

Микрореакция ставится по тому же принципу, что и РСК, но с меньшими объемами в микроплатах

в лунках геля из агара, содержащего эритроциты барана и

комплемент.
После внесения в лунки геля гемолитической сыворотки (антител против эритроцитов барана) вокруг них, в результате радиальной диффузии антител, образуется зона гемолиза.
Таким образом можно определить активность комплемента и гемолитической сыворотки, а также антитела в сыворотке крови у больных гриппом, краснухой, клещевым энцефалитом.
Для этого на эритроцитах адсорбируют соответствующие антигены вируса, а в лунки геля, содержащего данные эритроциты, добавляют сыворотку крови больного. Противовирусные антитела взаимодействуют с вирусными антигенами, адсорбированными на эритроцитах, после чего к этому комплексу присоединяются компоненты комплемента, вызывая гемолиз

реакция Кунса) - качественный метод выявления специфических Аг с помощью

Ат, конъюгированных с флюорохромом. Обладает высокой чувствительностью и специфичностью.
Применяется для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний (идентификация возбудителя в исследуемом материале), а также для определения Ат и поверхностных рецепторов и маркеров лейкоцитов (иммунофенотипирование) и др. клеток.

Обнаружение бактериальных и вирусных антигенов в инфек­ционных материалах, тканях животных и культурах клеток при помощи флюоресцирующих антител (сывороток) получило широкое применение в диагностической практике.

Приготовление флюоресцирующих сывороток основано на спо­собности некоторых флюорохромов (например, изотиоцианата флюоресцеина) вступать в химическую связь с сывороточными белками,  не    нарушая    их    иммунологической   специфичности.

метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы,

обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа.

Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета. 

АГС (антиглобулиновая
сыворотка)

Пневмококки

комплекса антиген - антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела)

сыворотки, меченной флюорохромом.

Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают специфическими антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки.

Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами.

В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом.

Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.. 

Treponema pallidum

иммунологический метод качественного или количественного определения различных соединений, макромолекул,

вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело.
Метод основан на использовании антител с использованием фермента в качестве метки.

С помощью ИФА определяют наличие антигенов возбудителей различных инфекций, но значительно чаще метод ИФА применяется для определения наличия антител классов IgA, IgM, IgG  к антигенам различных возбудителей болезней.

Желтый цвет раствора в лунке является положительным результатом.
Фотография

микропланшета

При проведении этого варианта ИФА высокоспецифичные поли- или моноклональные антитела, адсорбированные на твердой фазе, инкубируют с исследуемым образцом.
После процедуры отмывания в лунки вносят меченные ферментом антитела (конъюгат)
Связанный с антителом фермент обнаруживают по изменению цвета раствора после добавления субстрата (перекись водорода) и хромогена

для выявления специфических антител.

В лунках панелей адсорбируют стандартный

антиген и инкубируют с образцами сыворотки или другого биологического материала, полученного от больного (спинномозговая жидкость, слюна и др.).

Специфические антитела, связавшиеся с антигеном на твердой фазе, выявляют с помощью антиглобулинового конъюгата(антиглобулиновая сыворотка с ферментной меткой).

В зависимости от цели анализа используют разные антиглобулиновые реагенты, выявляющие антитела всех изотипов, либо специфичные к отдельным классам и подклассам иммуноглобулинов.
Основное достоинство метода состоит в универсальности конъюгата. Один и тот же коньюгат может служить для выявления антител человека к самым разным антигенам в любых образцах.

меченых (конъюгат) и немеченых (исследуемых) антител за связывание с

антигеном, адсорбированным на твердой фазе.

Количество фермента, присоединившегося к твердой фазе, уменьшится пропорционально содержанию в смеси свободных антител.

Для определения антигена используется тот же вариант, но в этом случае искомый антиген конкурирует с меченым, стандартным антигеном за связывание с антителами, иммобилизованными на поверхности твердой фазы

 Искомый антиген(1)
и меченый ферментом антиген(2)
конкурируют друг с другом за антитела (3), сорбированные на твердой фазе.

анализато

антигеном, меченным радиоактивным изотопом, подавляется в присутствии немеченного антигена.

Методика РИАпроста и включает следующие основные этапы:

А. К раствору антител добавляют меченный антиген и пробу (содержащую неизвестное количество немеченного антигена). Концентрацию антител в реакционной смеси подбирают так, чтобы число мест связывания было намного меньше общего числа антигенов. Концентрация меченного антигена должна превышать максимальную возможную концентрацию антигена в пробе.

Б. Реакционную смесь инкубируют при определенной температуре. Меченный и немеченный антигены конкурентно связываются с антителами, при этом образуются иммунные комплексы, содержащие либо меченный, либо немеченный антиген. Таким образом, к концу инкубации в реакционной смеси присутствуют меченные и немеченные иммунные комплексы, а также свободные меченные и немеченные антигены. Количество меченных иммунных комплексов обратно пропорционально количеству немеченного антигена в пробе.

В. Чтобы оценить количество меченных иммунных комплексов, их отделяют от свободного меченного антигена. Иммунные комплексы, имеющие большую молекулярную массу, чем свободные антигены, осаждают центрифугированием и измеряют радиоактивность осадка.

Г. Определяют концентрацию антигена в пробе по калибровочной кривой.

Рис. 8. Радиоиммунологический анализ:1 - антиген; 2 - антитело; 3 - радиоактивная метка.

Радиоиммунологический анализ:
1 - антиген;
2 – стандартныйантиген с радиоактивной меткой;
3 - антитело.

РИА - один из самых чувствительных методов иммунодиагностики. Его применяют для выявления антигена вируса гепатита В , у больных вирусным гепатитом. 

1

2

3

переносят их (блоттинг - от англ, blot, пятно) из

геля на активированную бумагу (1) или нитроцеллюлозную мембрану
и проявляют с помощью ИФА.

Фирмы выпускают такие полоски с "блотами" антигенов. На эти полоски (стрипы) наносят сыворотку больного (2). Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом (3).
Образовавшийся на полоске комплекс [антиген + антитело больного + антитело против Ig человека] выявляют добавлением хромогенного субстрата (4), изменяющего окраску под действием фермента.

Пример: Лайн-блот для диагностики TORCH-инфекций (Токсоплазмоз, Краснуха, Цитомегаловирус, ВПГ 1 и ВПГ 2)