Презентация на тему Масс-спектрометрия в протеомных исследованиях. Часть 1: Масс-спектрометрия

«bottom-up», «shot-gun» протеомика

(Белок оболочки Х-вируса картофеля)

Пептидный фингерпринт

Num From-To MH+ HPLC pI Sequence
1 1- 19 1836.92 14,27 9,85 SAPASTTQPIGSTTSTTTK
1 1- 19 1878.93 14,27 9,85 SAPASTTQPIGSTTSTTTK
2 20- 44 2472.20 24,79 3,92 TAGATPA..PDGDFFSTAR
3 45- 60 1602.83 12,87 4,11 AIVASNAVATNEDLSK
4 61- 66 759.44 19,33 6,99 IEAIWK
5 67- 69 393.18 4,27 6,99 DMK
6 70- 84 1673.83 19,51 3,92 VPTDTMAQAAWDLVR
7 85-109 2595.13 22,48 4,34 HCADVGSS..GPYSNGISR
8 110-111 246.16 1,78 11,20 AR
9 112-117 586.39 12,82 10,10 LAAAIK
10 118-123 719.36 14,84 6,29 EVCTLR
11 124-128 655.28 17,08 8,68 QFCMK
12 129-157 3410.65 28,07 9,42 YAPVVWNWM..QGFKPEHK
13 158-176 2058.02 24,21 6,97 FAAFDFFNGVTNPAAIMPK
14 177-198 2330.18 20,92 4,60 EGLIRPPS..AAQTAAFVK
15 199-201 361.25 6,80 10,15 ITK
16 202-203 246.16 1,78 11,20 AR
17 204-218 1565.76 14,77 3,92 AQSNDFASLDAAVTR
18 219-220 232.14 2,11 11,15 GR
19 221-236 1567.86 17,90 3,15 ITGTTTAEAVVTLPPP

Num From-To MH+ HPLC pI Sequence
1 1- 56 5430.68 29,08 4,35 SAPASTTQPI…IVASNAVATNE
1 1- 56 5472.69 29,08 4,35 SAPASTTQPI…IVASNAVATNE
2 57- 62 704.38 12,90 4,11 DLSKIE
3 63- 96 3730.75 28,42 4,58 AIWKDMKVPT..ADVGSSAQTE
4 97-118 2334.22 22,73 9,58 MIDTGPYSNGISRARLAAAIKE
5 119-155 4353.07 35,01 9,02 VCTLRQFCMKY…NWQAQGFKPE
6 156-177 2452.21 24,30 7,58 HKFAAFDFFNGVTNPAAIMPKE
7 178-185 868.49 16,16 7,04 GLIRPPSE
8 186-187 219.10 1,83 3,25 AE
9 188-228 4255.19 24,38 10,52 MNAAQTAAFV…RGRITGTTTAE
10 229-236 793.48 14,07 6,96 AVVTLPPP

Трипсин ( /R,K)
Стафилококковая протеаза V8 ( /E)

Пептидный калькулятор GPMAW 4.04

и получает масс-спектры молекул кислорода, азота, угарного газа, углекислого

газа и фосгена.
1948 год — Камероном и Эггером создан первый масс-спектрометр с время-пролётным масс-анализатором.
1953 год — Пауль патентует квадрупольный масс-анализатор и ионную ловушку.
1956 год — МакЛаферти и Голке создают первый газовый хромато-масс-спектрометр.
1966 год — Мансон и Филд создают ионный источник с химической ионизацией.
1972 год — Каратаев и Мамырин изобретают время-пролётный масс-анализатор с фокусировкой, значительно улучшающий разрешение анализатора.
1974 год — Первый жидкостный хромато-масс-спектрометр создан Арпино, Болдуином и МакЛаферти
1981 год — Барбер, Бордоли, Седжвик и Тайлор создают ионизатор с бомбардировкой быстрыми атомами (FAB).
1982 год — Первый масс-спектр целого белка (инсулин) с помощью бомбардировки быстрыми атомами (FAB).
1983 год — Бланки и Бестал изобретают термоспрей.
1984 год — Галль, а затем Фенн публикуют работы по методу электроспрей.
1987 год — Карас, Бахман, Бар и Хилленкамп изобретают ионизацию лазерной десорбцией при содействии матрицы (MALDI).
1999 год — Александр Макаров изобретает электростатическую ионную ловушку.

расчет молекулярной массы ионов
по их поведению в электрических и/или

магнитных полях

Сила, действующая на ион массы m и заряда z
в однородном электрическом поле:

Сила, действующая на ион массы m, заряда z, скорости v
в однородном магнитном поле:

Примеры:

Fq = zeE

FL = ze[vxB]

a = (z/m)eE

a = (z/m)e[vxB]

m/z

МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ

(IT)
Ионно-циклотронного резонанса (ICR-FT)
Микроканальные
пластины (MCP)
Диноды
Магнит (ICR-FT)
Положительные: - захват протона либо

другого катиона (Na, K);
- потеря электрона (катион-радикал).

Отрицательные: - утрата протона;
- захват электрона.

Типы ионов

ионизация (CI)
электронный захват (EC)
ионизация в электрическом поле

(FI)
Жидкая фаза
термоспрей
ионизация при атмосферном давлении (AP)
электроспрей (APESI)
химическая ионизация при атмосферном давлении (APCI)
фотоионизация при атмосферном давлении (APPI)
Твёрдая фаза
прямая лазерная десорбция - масс-спектрометрия (LDMS)
матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (MALDI)
масс-спектрометрия вторичных ионов (SIMS)
бомбардировка быстрыми атомами (FAB)
десорбция в электрическом поле (FD)
плазменная десорбция (PD)

(англ. Sector instrument)
Квадрупольный масс-анализатор (англ. Quadrupole mass analyzer)

Импульсные масс-анализаторы
Времяпролётный масс-анализатор (англ. Time-of-flight mass spectrometry)
Ионная ловушка (англ. Ion trap)
Квадрупольная линейная ловушка (англ. Quadrupole ion trap)
Масс-анализатор ионно-циклотронного резонанса с Фурье-преобразованием (англ. Fourier transform ion cyclotron resonance)
Орбитрэп (англ. Orbitrap)
Тандемные масс-анализаторы
Квадруполь-квадрупольный (3Q)
Квадруполь-времяпролетный (Q-TOF)
другие

коллекторы Фарадея

метанол
Анализируемое вещество
подается в растворе через капилляр с поданым на

него напряжением.

несколько последовательных
«упариваний-взрывов» микрокапель

В результате получаются
многозарядные газофазные ионы, захватившие на себя разное
количество протонов,
вплоть до максимально возможного.

ИСТОЧНИКИ ИОНОВ

МАТРИЦА:
* Поглощает энегрию лазерного излучения,
“вскипая”,

увлекает в газовую фазу
молекулы анализируемого вещества
* Способствует ионизации

Матрицы для УФ лазера (336нм)

Лазер: 2нс, 50-300 мкДж/имп , 50мкм

Анализируемое вещество
(раствор 10-4 -10-8 М, <1 мкл)
смешивается с матрицей
(раствор 10-1 -10-2 М, <1 мкл),
высушивается на подложке, образуя кристаллоиды

MALDI - matrix assisted laser desorption / ionization лазерная десорбция и ионизация в присутствии вспомогательного вещества - матрицы

гриппа

как правило,
однозарядные ионы, захватившие протон
либо иной катион.

MALDI : типы

положительных ионов и вид спектра

углерода
в нем с вероятностью ~ 30% не встретится 13С,
с

вероятностью ~ 37% встретится один 13С,
с вероятностью ~ 20% встретится два 13С.

NB: в масс-спектре детектируется 103 – 106 молекул аналита.
Этого достаточно для наблюдения изотопного рапределения.
Моноизотопная масса – масса пептида, не содержащего ни одного13С

вид MALDI
масс-спектра

вид ESI
масс-спектра

моноизотопнная
масса

средняя (average)
масса

Естественное изотопное распределение в белках и пептидах

анализируемого вещества.
* Диапазон концентрации аналита при ESI и

MALDI 10-3 – 10-7 M.
* Поскольку разные вещества (например, пептиды) обладают разной
способностью к ионизации (захвату протона либо другого катиона),
то невозможно делать выводы о количественном соотношении
компонентов сложной смеси на основании высот пиков в спектре.

При ESI образуется непрерывный поток ионов,
при MALDI - сильно ограниченный во времени (до 10нс) пакет ионов.

При ESI анализу подлежит более 10 фемтомолей вещества,
при MALDI - более 1 фемтомоля вещества.

При ESI образуются ионы m/z 0-5000,
возможно измерение белков до ~50 000 Да.
При MALDI возможно измерение белков до ~200 000 Да,
диапазон измеряемых масс ограничен снизу до ~500 Да
из-за присутсвия с спектрах пиков матрицы.

ESI является более “мягким” способом ионизации, чем MALDI.

Замечания о ESI и MALDI:

приводящий к уширению пиков.
Энергия ускорения 20 кэВ и длина

пути 1м

При энергии ускорения 20 кэВ разброс в 100эВ
составляет 0.5%.
Так пик пептида м.в. 1000Д имел бы ширину
на половине высоте около 2 Да !

MALDI-времяпролетный масс-спектрометр с MCP детектором

разброса ионов –

повышение разрешения MALDI-TOF-MS

точность MALDI-TOF-MS

в области свободного дрейфа, фрагменты имеют
ту же скорость,

что и их родительский ион, а энергию - меньшую (~ m)

Распад ионов в процессе MALDI

масс-спектров с разным U рефлектрона
компьютерно “сшиваются” в один

спектр PSD

получается один спектр фрагментации TOF-TOF

точность измерения масс фрагментов 0.02-0.1%

PSD (post source decay) и TOF-TOF детекция распада ионов во время свободного дрейфа

напряжение.
На короткое время отталкивающее напряжение с верхнего электрода снимается,

позволяя пакету ионов влететь в ловушку.
На центральном электроде -быстропеременное напряжение,
которое заставляет ионы всех m/z двигаться со своими частотами по своим орбитам.

Затем, на экстрагирующие линзы подается осцилируещее напряжение, последовательно вытягивающее ионы согласно их m/z.

Характеристиками ловушки являются:
ёмкость (верхнее значение разделяемых m/z ) до 4000,
разрешение до 0.2 Да по диапазону,
точность до 0.01% (=100ppm) для родительских ионов и фрагментов.

Ионные ловушки позволяют, варьируя напряжения, оставлять в ловушке определенные ионы и получать спектры их фрагментов.
При этом возможен ряд последовательных фрагментаций иона.

Ионная ловушка хорошо сочетается с жидкостным хроматографом.

ESI – ионная ловушка с МСР детектором

выделения (включением квадруполя) определенных ионов для получения спектров фрагментации.
На

электроды квадруполя подается переменное напряжение, позволяющее пролетать только резонансным ионам.

Напуск инертного газа приводит
к столкновительной фрагментации ионов.

точность 0.01-0.03% для родительских ионов и фрагментов

«Гибридные» приборы: ESI – квадруполь – ортогональный времяпролетный МС

где вращаются под действием силы Лоренца
с частотой, зависящей

от m/z.

Два сектора магнита используются для снятия токов, наведенных пролетающими мимо них ионами.
Сложный сигнал от ионов разных m/z
подлежит разложению по частотам
(Фурье-преобразованию).

Характеристики ICR-FT :
разрешение до 10 000 000,
точность до 0.0001% (=1ppm).

ESI - масс-спектрометры ионно-циклотронног резонанса с последующим Фурье- преобразованием (ICR-FT)

(распределение зарядов и водородный обмен)
Как определить молекулярную массу

белка из ESI масс-спектров
Определить заряды используя m/z рядом стоящих ионов
Zx=(Y-1)/(X-Y)
Определить массу белка
M=X*zx-zx=Y*zy-zy