Что такое findslide.org?

FindSlide.org - это сайт презентаций, докладов, шаблонов в формате PowerPoint.


Для правообладателей

Обратная связь

Email: Нажмите что бы посмотреть 

Яндекс.Метрика

Презентация на тему Nk-клетки

Содержание

NK-клеткибольшие гранулярные лимфоциты, обладающие цитотоксичностью противопухолевых клеток и клеток, зараженных вирусами. В настоящее время NK-клетки рассматривают как отдельный класс лимфоцитов. NK выполняют цитотоксические и цитокин-продуцирующие функции. NK являются одним из важнейших компонентов клеточного врождённого иммунитета.
NK-клеткибольшие гранулярные лимфоциты, обладающие цитотоксичностью противопухолевых клеток и клеток, зараженных вирусами. В настоящее время NK-клетки ХарактеристикаЗадача- выявлять и уничтожать собственные клетки организма, в которых что-то нарушилось.Составляют 5% МаркёрыNK-клетки не имеют основных маркёров Т- или B-лимфоцитов (поэтому их также называют РецепторыNK-клетки уничтожают клетку-мишень после установления с ней прямого контакта при помощи специальных Роль цитокиновАктивность NK-клеток регулируют цитокины (у-ИФН и ИЛ-2 усиливают их цитолитическую активность). Развитие Современные методы выделения лимфоцитов и других клеток Для выделения мононуклеаров крови наиболее широкое распространение получил метод дифференциального центрифугирования в Для выделения моноцитов из суммарной фракции мононуклеаров самый простой и доступный метод Разделение клеток в градиенте плотностиМатериалы и оборудование. Для работы необходимы: центрифуга с Центрифугирование в градиенте плотностиВвиду разнообразия применяемых методов фракционирования клеток в градиенте плотности ступенчатый градиент плотностиОдновременное разделение эозинофилов, нейтрофилов и моноцитов человека в градиенте фиколл/гипак:(A) 15,0 Составляют градиент осторожно, наслаивая друг на друга по 2,0 мл растворов уменьшающейся Разделение гранулоцитов и фракции лимфоциты/моноциты человека в градиенте фиколл/триомбраст:(А) 10 объемов 34% Изокинетическое разделениеИзокинетическое разделение используют при необходимости разделять клетки одинаковой плотности, но различной Все многообразие методов разделения клеток можно видеть на примере разделения моноцитов и Седиментация в градиенте плотностиФракционирование клеток различной величины чаще всего проводят в седиментационной Идентификация T-лимфоцитов1. Выделение чистых лимфоцитов в градиенте определенной плотности (различной для разных 4. Постановка реакции. К 0,25 мл рабочей взвеси лимфоцитов добавляют 0,25 мл 5. Готовят мазки па предметных стеклах методом толстой капли; фиксируют метиловым спиртом 6. Учет реакции. Под иммерсионной системой микроскопа подсчитывают 100 лимфоцитов (увеличение 90х7), Идентификация В-лимфоцитов1. Эритроциты барана трижды отмывают раствором Хенкса и готовят 5%-ную взвесь 5. Отмытые эритроциты инкубируют с равным объемом комплемента при 37 °C в Оценка функциональной активности NK-клеток с использованием проточной цитометрии В качестве метки для КМ применяют флуоресцентный краситель 5-, 6-карбоксифлуоресцеин диацетатсукцинилмидиловый эфир Первоначально нефлуоресцирующий КФДЭ проникает через клеточную мембрану. Карбоксифлуоресцеины связываются с внутриклеточными молекулами, После окончания культивирования клетки окрашивают пропидий йодидом для определения убитых в ходе
Слайды презентации

Слайд 2 NK-клетки
большие гранулярные лимфоциты, обладающие цитотоксичностью противопухолевых клеток и клеток, зараженных вирусами.

NK-клеткибольшие гранулярные лимфоциты, обладающие цитотоксичностью противопухолевых клеток и клеток, зараженных вирусами. В настоящее время

В настоящее время NK-клетки рассматривают как отдельный класс лимфоцитов. NK

выполняют цитотоксические и цитокин-продуцирующие функции. NK являются одним из важнейших компонентов клеточного врождённого иммунитета.

Слайд 3 Характеристика
Задача- выявлять и уничтожать собственные клетки организма, в

ХарактеристикаЗадача- выявлять и уничтожать собственные клетки организма, в которых что-то нарушилось.Составляют

которых что-то нарушилось.
Составляют 5% лимфоцитов периферической крови
Фенотип: CD3-CD16+CD56+CD94+ и

гаметное (неперестроенное) расположение генов.


Слайд 5 Маркёры
NK-клетки не имеют основных маркёров Т- или B-лимфоцитов

МаркёрыNK-клетки не имеют основных маркёров Т- или B-лимфоцитов (поэтому их также

(поэтому их также называют нулевые лимфоциты), но экспрессируют дифференцировочные

CD2, CD56 и CD16 (рецептор Fc-фрагмента AT) Аг. В отличие от цитотоксических лимфоцитов, способность NK-клеток к цитолизу связана со самостоятельным распознаванием «своё-чужое» на поверхности мишени.


Слайд 6 Рецепторы
NK-клетки уничтожают клетку-мишень после установления с ней прямого

РецепторыNK-клетки уничтожают клетку-мишень после установления с ней прямого контакта при помощи

контакта при помощи специальных белков — перфоринов. Перфорины встраиваются

в мембрану чужеродной или трансформированной клетки, образуя в ней «дыру», приводящую к необратимому и гибельному выравниванию ионного состава между цитоплазмой и внешней средой.


Слайд 8 Роль цитокинов
Активность NK-клеток регулируют цитокины (у-ИФН и ИЛ-2

Роль цитокиновАктивность NK-клеток регулируют цитокины (у-ИФН и ИЛ-2 усиливают их цитолитическую

усиливают их цитолитическую активность). Наряду с макрофагами, нейтрофилами и

эозинофилами они также участвуют в антителозависимом клеточно-опосредованном цитолизе. Для этого NK-клетки экспрессируют на своей поверхности рецептор Fc-фрагмента IgG (GD16). Реакция зависит от присутствия AT, узнающих клетку-мишень и связывающихся с ней. Fc-фрагмент связанных с клеткой-мишенью AT взаимодействует с рецептором Fc-фрагмента, встроенным в плазматическую мембрану NK-клетки. Природа агента, убивающего клетку-мишень в этом случае, неизвестна.


Слайд 9 Развитие

Развитие

Слайд 10 Современные методы выделения лимфоцитов и других клеток

Современные методы выделения лимфоцитов и других клеток

Слайд 11 Для выделения мононуклеаров крови наиболее широкое распространение получил

Для выделения мононуклеаров крови наиболее широкое распространение получил метод дифференциального центрифугирования

метод дифференциального центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографин (с плотностью

1.077 г/см3). После центрифугирования образуется осадок эритроцитов и гранулоцитов на дне пробирки, над ним находится слой смеси фиколл-верографин, а на границе между этим слоем и верхним слоем плазмы крови располагается тонкий слой (в виде кольца) мононуклеаров крови, которые отличаются от других форменных элементов значительно меньшей плотностью. После отмывания мононуклеаров от смеси фиколл-верографин и от плазмы подсчитывают количество выделенных клеток, среди которых обычно 70—90 % составляют лимфоциты, а на долю моноцитов приходится от 10 до 30 % (примесь гранулоцитов не должна превышать 2 %, жизнеспособность выделенных клеток, по данным теста с трипановым синим, должна быть не ниже 98 %).

Слайд 12 Для выделения моноцитов из суммарной фракции мононуклеаров самый

Для выделения моноцитов из суммарной фракции мононуклеаров самый простой и доступный

простой и доступный метод основан на избирательной способности моноцитов

(в отличие от большинства лимфоцитов) быстро и прочно прикрепляться к поверхности стекла или пластика. Инкубация смеси моноцитов с лимфоцитами в течение 2—24 ч используется для их разделения на прилипающую (моноциты) и неприлипающую (лимфоциты) фракции.

Слайд 13 Разделение клеток в градиенте плотности
Материалы и оборудование. Для

Разделение клеток в градиенте плотностиМатериалы и оборудование. Для работы необходимы: центрифуга

работы необходимы: центрифуга с охлаждением, бакет-ротор, градиентный смеситель, вещества

для формирования градиента, такие, как альбумин, сыворотка эмбрионов коров, фиколл, лимфопреп, перколл (Pharmacia, Швеция), визотраст или другие рентгеноконтрастные вещества.

Слайд 14 Центрифугирование в градиенте плотности
Ввиду разнообразия применяемых методов фракционирования

Центрифугирование в градиенте плотностиВвиду разнообразия применяемых методов фракционирования клеток в градиенте

клеток в градиенте плотности невозможно в рамках настоящей главы

дать их детальный разбор. В зависимости от биологического вида, органного происхождения, стадии жизненного цикла и активации плотность лимфоцитов, макрофагов, гранулоцитов варьирует в пределах 1,04—1,12 г/мл. Обычно разброс величин плотности составляет около половины этого интервала. Условия центрифугирования подбираются индивидуально в зависимости от характера эксперимента, основные варианты представлены в таблице:

Слайд 16 ступенчатый градиент плотности
Одновременное разделение эозинофилов, нейтрофилов и моноцитов

ступенчатый градиент плотностиОдновременное разделение эозинофилов, нейтрофилов и моноцитов человека в градиенте

человека в градиенте фиколл/гипак:
(A) 15,0 мл 9% фиколла + 10,0

мл 50% гипака; плотность 1,14 г/мл.
(Б) 17,5 мл 9% фиколла + 10,0 мл 50 гипака; плотность 1,13 г/мл.
(B) 20,0 мл 9% фиколла+10,0 мл 50% гипака; плотность 1,12 г/мл.
(Г) 24,0 мл 9% фиколла + 10,0 мл 50% гипака; плотность 1,06 г/мл.


Слайд 17 Составляют градиент осторожно, наслаивая друг на друга по

Составляют градиент осторожно, наслаивая друг на друга по 2,0 мл растворов

2,0 мл растворов уменьшающейся плотности. Сверху наслаивают 2,0 мл

гепаринизированной крови, разведенной в соотношения 1:2 0,15 М NaCl. Центрифугируют 40 минут при 1000 g и 22°С. Клетки распределяются тогда между различными слоями следующим образом: между плазмой и слоем Г — моноциты и лимфоциты с 97—100% чистотой, между Г и В — нейтрофилы с 94—99% чистотой, между В и Б — непрофилы (50—98%) и эозинофилы (2—50%), между Б и А —эозинофилы с 80—99% чистотой.

Слайд 18 Разделение гранулоцитов и фракции лимфоциты/моноциты человека в градиенте

Разделение гранулоцитов и фракции лимфоциты/моноциты человека в градиенте фиколл/триомбраст:(А) 10 объемов

фиколл/триомбраст:
(А) 10 объемов 34% триомбраста плотность 1,075 г/мл при

22°С
24 объема 9% фиколла (Б) 10 объемов 34% триомбраста плотность 1,097 г/мл при 22°С 24 объема 14,6% фиколла
На градиент, составленный из 5 мл фракции А и 5 мл фракции Б, наслаивают 10 мл разведенной в соотношении 1:2 гепаринизированной крови. Центрифугируют 40 минут при 400 g и 22°С. Легкая фракция содержит лимфоциты (свыше 60%), моноциты (свыше 35%) и гранулоциты (около 1%).
Плотная фракция содержит 98% гранулоцитов, их выход составляет 60%.


Слайд 19 Изокинетическое разделение
Изокинетическое разделение используют при необходимости разделять клетки

Изокинетическое разделениеИзокинетическое разделение используют при необходимости разделять клетки одинаковой плотности, но

одинаковой плотности, но различной величины. Если используется градиент фиколла

2,6—5,5%, то центрифугирование проводят при 18,7 и 97 g в течение 30—14 мин. Результаты можно существенно улучшить, дополнив изокинетическое центрифугирование изо-пикническим.

Слайд 20 Все многообразие методов разделения клеток можно видеть на

Все многообразие методов разделения клеток можно видеть на примере разделения моноцитов

примере разделения моноцитов и лимфоцитов человека в градиенте перколла.

Раствор перколла (30 мл) с плотностью 1,060 г/мл в среде, не содержащей Са2+ и Mg2+, центрифугируют в течение 1 ч при 26 000 g для формирования градиента плотности. На этот градиент наслаивают 3,0 мл суспензии моноциты/лимфоциты (15х106/мл). Разделение моноцитов и лимфоцитов происходит в ходе изокинетического центрифугирования в течение 5 минут при 400 g. Выход высокогомогенной фракции моноцитов составляет около 50% от их содержания в крови.

Слайд 21 Седиментация в градиенте плотности
Фракционирование клеток различной величины чаще

Седиментация в градиенте плотностиФракционирование клеток различной величины чаще всего проводят в

всего проводят в седиментационной камере по принципу Miller и

Phillips. Диаметр таких камер обычно варьирует от 11 до 21 см, но известны и камеры меньшего размера. Для стабилизации разделяющей жидкости и предотвращения конвенции градиент формируют из сыворотки эмбрионов коров. Готовят суспензию клеток (107/мл) в 3% сыворотке эмбрионов коров. В камере диаметром 11 см седиментируют 20 мл, диаметром 21 см—100 мл суспензии клеток. Градиент формируется в процессе центрифугирования, которое происходит при 4°С н длится 3,5—4,5 ч. Клетки сорбируют фракциями по 12—15 мл.

Слайд 22 Идентификация T-лимфоцитов
1. Выделение чистых лимфоцитов в градиенте определенной

Идентификация T-лимфоцитов1. Выделение чистых лимфоцитов в градиенте определенной плотности (различной для

плотности (различной для разных видов животных) методом дифференциального центрифугирования. 2.

Получение рабочей взвеси лимфоцитов в концентрации 3—4 млн клеток в 1 мл в забуференном фосфатами физиологическом растворе (pH 7,41) с добавлением 2,5% эмбриональной телячьей сыворотки. 3. Приготовление 0,5%-ной суспензии трижды отмытых физиологическим раствором эритроцитов барана.

Слайд 23 4. Постановка реакции. К 0,25 мл рабочей взвеси

4. Постановка реакции. К 0,25 мл рабочей взвеси лимфоцитов добавляют 0,25

лимфоцитов добавляют 0,25 мл 0,5%-ной взвеси отмытых эритроцитов. После

выдерживания при температуре 18—20 °C в течение 20—25 мин центрифугируют при режиме 300—400 g и снова инкубируют при 4 °C в течение 15—18 ч. Осадок осторожно взбалтывают и добавляют по каплям 0,3 мл 0,6%-ного раствора глютарового альдегида на забуференном физиологическом растворе и фиксируют 15—20 мин. Затем трехкратно отмывают водой или физиологическим раствором, центрифугируя по 5 мин при 250—300 g и каждый раз осторожно ресуспензируя. После последнего центрифугирования надосадочную жидкость частично сливают и осадок вновь осторожно взбалтывают.

Слайд 24 5. Готовят мазки па предметных стеклах методом толстой

5. Готовят мазки па предметных стеклах методом толстой капли; фиксируют метиловым

капли; фиксируют метиловым спиртом 3—5 мин и окрашивают по

Романовскому — Гимза или другими красителями (водные растворы эозина, прочный или светлый зеленый и др.).

Слайд 25 6. Учет реакции. Под иммерсионной системой микроскопа подсчитывают

6. Учет реакции. Под иммерсионной системой микроскопа подсчитывают 100 лимфоцитов (увеличение

100 лимфоцитов (увеличение 90х7), неприсоединившие и присоединившие 3 и

более эритроцита. Определяют их процент к общему числу лимфоцитов и абсолютное содержание в 1 мл крови.

Слайд 27 Идентификация В-лимфоцитов
1. Эритроциты барана трижды отмывают раствором Хенкса

Идентификация В-лимфоцитов1. Эритроциты барана трижды отмывают раствором Хенкса и готовят 5%-ную

и готовят 5%-ную взвесь в этом растворе. 2. Получают рабочую

взвесь лимфоцитов с концентрацией 3—4 млн клеток в 1 мл. 3. Сухую гемолитическую сыворотку против эритроцитов барана разводят раствором Хенкса до титра 1:500. 4. Смешивают в равных объемах (1:1) 5%-ную взвесь эритроцитов барана и разведенную гемолитическую сыворотку, инкубируют при 37 °C в течение 30 мин и отмывают трижды путем центрифугирования при 80 g в течение 5 мин.

Слайд 28 5. Отмытые эритроциты инкубируют с равным объемом комплемента

5. Отмытые эритроциты инкубируют с равным объемом комплемента при 37 °C

при 37 °C в течение 30 мин и отмыкают

трижды в том же режиме. 6. Смешивают рабочую взвесь лимфоцитов с отмытыми сенсибилизированными эритроцитами барана в соотношении 1:50. Инкубируют при 37 °C в течение 30 мил при слабом перемешивании. 7. Готовят препараты на покровных стеклах, фиксируют метиловым спиртом и окрашивают по Романовскому — Гимза. 8. Определяют процент и абсолютное число лимфоцитов, образовавших розетки (клетки, присоединившие 3 и более эрифоцита). Можно также подсчитывать ЕАС-розетки в любой счетной камере.

Слайд 30 Оценка функциональной активности NK-клеток с использованием проточной цитометрии

Оценка функциональной активности NK-клеток с использованием проточной цитометрии

Слайд 31 В качестве метки для КМ применяют флуоресцентный краситель

В качестве метки для КМ применяют флуоресцентный краситель 5-, 6-карбоксифлуоресцеин диацетатсукцинилмидиловый

5-, 6-карбоксифлуоресцеин диацетатсукцинилмидиловый эфир (КФДЭ), который образует прочную ковалентную

связь с внутриклеточными белками и в используемой концентрации не влияет на жизнеспособность клетки. 

Слайд 32 Первоначально нефлуоресцирующий КФДЭ проникает через клеточную мембрану. Карбоксифлуоресцеины

Первоначально нефлуоресцирующий КФДЭ проникает через клеточную мембрану. Карбоксифлуоресцеины связываются с внутриклеточными

связываются с внутриклеточными молекулами, формируя конъюгаты, обеспечивая стойкое флуоресцентное

окрашивание клетки. Окрашенные таким образом КМ К-562 смешивают с КЭ и инкубируют в течение нескольких часов. 

  • Имя файла: nk-kletki.pptx
  • Количество просмотров: 181
  • Количество скачиваний: 0
- Предыдущая Happy birthday, Ксю! =*
Следующая - Общение