Презентация на тему Основы генетической инженерии

с помощью которых получают фрагменты ДНК (рестриктазы);

ферменты, синтезирующие

ДНК на матрице ДНК (полимеразы) или РНК (обратные транскриптазы);

ферменты, соединяющие фрагменты ДНК (лигазы);

ферменты, позволяющие осуществить изменение структуры концов фрагментов ДНК.

Тема №2

определенные последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК (сайты рестрикции).

Тема

№2

Haemophilus influenzae первую рестриктазу, которая расщепляла строго определенную последовательность

ДНК (Hind III).

Тема №2

остаткам в том же сайте, в котором связывается рестрикционный

фермент. В результате метилирования сайт становится устойчивым к рестрикции, т.е. метилирование защищает ДНК от разрезания.

Тема №2

последовательности GATC. В таком случае многие рестриктазы (например, BclI,

MboI или ClaI), в состав сайтов рестрикции которых входит данная метилированная последовательность, перестают расщеплять ДНК по этим сайтам.

dcm-метилазы

Аналогичное действие на некоторые рестриктазы, например EcoRII, оказывает и dcm-метилаза, осуществляющая метилирование остатков цитозина по положению С5 в последовательностях CCAGG и CMe--CTGG.

Для того чтобы избежать нежелательного влияния этих метилаз на клонируемые ДНК, в качестве хозяев используют мутантные штаммы E. coli: dam и dcm. ДНК-метилазы бактериальных систем рестрикции и модификации применяют для блокирования in vitro соответствующих сайтов рестрикции на исследуемых фрагментах ДНК с целью получения под действием гомологичных рестриктаз фрагментов больших размеров.

Тема №2

определенные последовательности

1 класс. Осуществляют разрывы в произвольных точках молекулы

ДНК. Имеют сложную субъединичную структуру и обладают двумя типами активностей - модифицирующей (метилирующей) и АТФ-зависимой эндонуклеазной.

2 класс. Узнают и расщепляют ДНК в строго определенных точках внутри сайтов узнавания или на фиксированном от них расстоянии. состоят из 2 отдельных белков: рестрицирующей эндонуклеазы и модифицирующей метилазы, поэтому в генной инженерии используются исключительно ферменты 2-го класса. Они нуждаются в ионах Mg в качестве кофакторов.

3 класс. Узнают и расщепляют ДНК в строго определенных точках внутри сайтов узнавания или на фиксированном от них расстоянии. имеют сложную субъединичную структуру и обладают двумя типами активностей - модифицирующей (метилирующей) и АТФ-зависимой эндонуклеазной.

Тема №2

встречаются такие, которые узнают на ДНК одни и те

же последовательности.

Гетерошизомеры - ферменты, узнавая один и тот же сайт на ДНК, производят разрывы в разных точках в пределах того же сайта.

Тема №2

производной от бинарного названия микроорганизма, содержащего данную метилазнорестриктазную систему.

Составляют по правилу: к первой прописной букве названия рода добавляют две первые строчные буквы вида.
Streptomyces albus - Sal, Escherichia coli - Eco

2) В случае необходимости добавляют обозначение серотипа или штамма, например, Есо B.

3) Различные системы рестрикции - модификации, кодируемые одной бактериальной клеткой, обозначают римскими цифрами: Hind II, Hind I, Hind III (Haemophilus influenzae).

4) Рестриктазы обозначают буквой R (R Hind III), метилазы - М (М Hind III).

Тема №2

ферментом эндонуклеазой рестрикции-модификации (рестриктазой).

Рестриктаза связывается с молекулой ДНК в точке

расположения сайта рестрикции и перерезает цепочку нуклеотидов внутри сайта или в непосредственной близости от него.

Размер сайта рестрикции различных рестриктаз составляет, как правило, 4-6 нуклеотидов.

Сайты рестрикции в ДНК самой бактерии замаскированы посредством метилирования остатков А и С.

Например, фермент рестрикции EcoRI распознаёт симметричную последовательность GAATTC и перерезает цепочку между нуклеотидами G и A, оставляя на концах перекрывающиеся участки AATT.

Тема №2

часто выступают палиндромы из 46 пар оснований - сайты

рестрикции.
Сайт-мишень может быть полностью метилирован (обе цепи модифицированы), полуметилирован (только одна цепь метилирована) или не метилирован.

Реакция разрезания осуществляется в две ступени. Сначала разрезается одна цепь ДНК, а затем рядом разрезается другая. В областях, прилегающих с каждой стооны к сайту разрезания, может иметь место экзонуклеотическая деградация. Происходит эффективный гидролиз АТФ, роль которого еще не выяснена.

Тема №2

из мономерной полипептидной цепи с молекулярной массой 109 кДа

и имеет 3-х доменную структуру. Каждый домен обладает своей ферментативной активностью: 5’ – 3’ полимеразной, 3’ – 5’ экзонуклезной, 5’ – 3’ экзонуклеазной.

Тема №2

с молекулой ДНК

одноцепочечной ДНК-матрицы и комплементарного участку этой цепи фрагмента —

праймера (затравки) с 3'-ОН концом.
 
3’- 5’ экзонуклеазная активность.
Гидролизует одноцепочечную или двухцепочечную ДНК с 3'-ОН конца. 3’-5’ нуклеаза расщепляет диэфирную связь только в неспаренных участках ДНК.

5‘-3' экзонуклеазная активность.
Деградирует одну цепь двухцепочечной ДНК, начиная со свободного 5'-конца. В отличие от 3'—5' экзонуклеазы 5'—3' экзонуклеаза расщепляет диэфирную связь только в спаренных участках двухцепочечной молекулы ДНК.

Тема №2

ДНК на матрице РНК в процессе обратной транскрипции
Тема №2

№2
Схема синтеза двухцепочечных ДНК-копий молекул РНК.

химической связи (лигирование).

При этом обычно происходит отщепление (гидролиз)

небольшой химической группы от одной из молекул.

Тема №2

используемого ими кофактора в качестве донора AMP:
ATP-зависимые лигазы

обнаруживают у бактериальных и эукариотических вирусов, архей, дрожжей, млекопитающих и эубактерий.

NAD-зависимые ДНК-лигазы имеются почти исключительно у эубактерий. Единственное известное исключение в этом отношении составляют энтомопоксвирусы насекомых Melanoplus sanguinipes и Amsacta moorei.

Тема №2

5’-OH группы ДНК или РНК.

Полинуклеотидкиназа бактериофага Т4 используется

для введения радиоактивной метки в ДНК или РНК с целью получения радиоактивно меченых зондов или секвенирования нуклеиновых кислот.

Тема №2

к 3’-OH-группам молекул ДНК
Тема №2

или РНК, а также расщепление макроэргических связей рибо- и

дезоксирибонуклеозидтрифосфатов.

Тема №2