Презентация на тему PCR - полимеразная цепная реакция

PCR, RT-PCR)
•Количественная ПЦР (Quantitative PCR, Q-PCR) или ПЦР

в реальном времени
•Метилспецифическая, метилчувствительная ПЦР
•ПЦР длинных фрагментов (Long-range PCR)
•Вложенная ПЦР (Nested PCR)
•Ступенчатая ПЦР (Touchdown, stepdown PCR)
•RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) — fingerprinting
•Инвертированная ПЦР (Inverse PCR), асимметричная ПЦР (asymmetric PCR)

из разновидностей полимеразной цепной реакции. Используется для одновременной амплификации

и измерения количества определенной молекулы ДНК.

Основное отличие состоит в том, что измеряется количество амплифицированной ДНК в реальном времени после каждого цикла амплификации. Для количественного определения применяют флуоресцентные красители и модифицированные олигонуклеотиды( ДНК- зонды).

Для ПЦР в реальном времени выпускают приборы, оборудованные флуоресцентным детектором.

реальном времени — используется для непосредственного наблюдения за измерением количества

конкретного ПЦР продукта в каждом цикле реакции.

продукта реакции по мере его наполнения
флуоресцентный интеркалирующий краситель Sybr

Green I

обеспечивает простой и экономичный вариант для детекции и количественного определения ПЦР-продуктов в ходе ПЦР в режиме реального времени без необходимости использования специфичных флуоресцентных зондов или праймеров.

сегодняшний день приборами для проведения ПЦР в режиме реального

времени. Максимум поглощения для SYBR Green I находится при длине волны 494 нм. Кроме главного, в спектре красителя имеются два небольших дополнительных максимума поглощения — при 290 нм и 380 нм. Максимум испускания для SYBR Green I находится при длине волны 521 нм (зелёный)

биотехнологических компаний. В их ассортименте – приборы для ПЦР

в реальном времени и классического ПЦР, термостаты, источники питания, ПЦР тест-системы.

Предназначен для регистрации результатов ПЦР при использовании тест-систем, основанных на принципах флуоресцентной детекции.

до 5 каналов флуоресценции;
долговечность источников света – светодиодов, отличающихся

высокой продолжительностью;
высокая чувствительность;
термоблок позволяет задавать градиент температуры отжига;
возможность автономного выполнения задания и восстановления программы;
простота управления

уменьшают влияние неспецифического связывания праймеров. Первые циклы проводят при

температуре выше оптимальной температуры отжига, затем каждые несколько циклов температуру отжига постепенно снижают до оптимальной. Это делается для того, чтобы праймер гибридизовался с комплементарной цепью всей своей длиной; тогда как при оптимальной температуре отжига, праймер частично гибридизуется с комплементарной цепью. Частичная гибридизация праймера на геномной ДНК приводит к неспецифической амплификации, если участков связывания для праймера достаточно много. В большинстве случаев, первые десять ПЦР циклов, можно проводить при температуре отжига в 72-75°С, а затем сразу снизить до оптимальной, например до 60-65°С.

и более последовательностей ДНК в одной пробирке.
Преимущество данного

метода:
возможность выявления ряда патогенов, генетических модификаций организмов и т.д., поместив пробу в одну пробирку.

Гнездовая («вложенная», англ. nested PCR) ПЦР

– применяется для уменьшения числа побочных продуктов реакции. Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции.

известен лишь небольшой участок
внутри нужной последовательности. Этот метод полезен,

когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном. Для этого проводят ряд разрезаний ДНК рестриктазами с последующим соединением фрагментов.

Ассиметричная ПЦР
– проводится тогда, когда нужно амплифицировать преимущественно одну
из цепей исходной ДНК. Используется в некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа. Сама ПЦР проводится как обычно, за исключением того, что один из праймеров берется в большом избытке.

PCR Colony) 
— акриламидный гель полимеризуют со всеми компонентами ПЦР

на поверхности и проводят ПЦР. В точках, содержащих анализируемую ДНК, происходит амплификация с образованием молекулярных колоний.

амплификации протяженных участков ДНК (10 тысяч и более оснований).

Используют смесь двух полимераз, одна из которых — Taq-полимераза с высокой процессивностью (то есть, способная за один проход синтезировать длинную цепь ДНК), а вторая — ДНК полимераза с 3'-5' экзонуклеазной активностью, обычно это Pfu полимераза. Вторая полимераза необходима для того, чтобы корректировать ошибки, внесённые первой, так как Taq-полимераза останавливает синтез ДНК если был добавлен не комплементарный нуклеотид. Этот не комплементарный нуклеотид удаляет Pfu полимераза. Смесь полимераз берется в отношении 50:1 или даже меньше 100:1, где Taq-полимеразы берётся в 25—100 раз больше по отношению к Pfu-полимеразе.

случайной амплификацией полиморфной ДНК — используется тогда, когда нужно различить

близкие по генетической последовательности организмы, например, разные сорта культурных растений, породы собак или близкородственные микроорганизмы. В этом методе обычно используют один праймер небольшого размера (около 10 п.н.). Этот праймер будет частично комплементарен случайным участкам ДНК исследуемых организмов. Подбирая условия (длину праймера, его состав, температуру и пр.), удаётся добиться удовлетворительного отличия картины ПЦР для двух организмов.

ПЦР, суть которой состоит в предотвращении возможности начала реакции

до момента достижения в пробирке условий, обеспечивающих специфический отжиг праймеров.

Полимеразная активность фермента в момент постановки ПЦР блокируется антителами или небольшими молекулами типа Affibody до наступления первой денатурации

Отделение полимеразы от реакционной смеси с использованием легкоплавкого парафина или специальных масел

Позволяет минимизировать вероятность образования неспецифических продуктов ПЦР и получения ложноположительных результатов анализа

ПЦР, е-ПЦР) — математический метод компьютерного анализа теоретической полимеразной цепной

реакции c использованием списка последовательностей праймеров (или ДНК-зондов) для предсказания потенциальной амплификации ДНК исследуемого генома, хромосомы, кольцевой ДНК или любого другого участка ДНК.