Слайд 2
Парадигма молекулярной биологии
ДНК
РНК
Белок
Вторичные метаболиты
Геномика
Трнскриптомика
Протеомика
Метаболомика
Слайд 3
Протеомика
Протеомика – область науки, изучающая белки, их функции
и взаимодействия.
В протеомике главным образом применяются высокопроизводительные методы анализа.
Proteomics
= protein + omics
Протеом (proteome) – совокупность всех белков клетки, ткани, организма, включая модификации этих белков.
Слайд 4
Протеомика
таргетная
нетаргетная
Слайд 5
Протеомика
Качественный анализ
установление структуры нового белка
альтернативный сплайсинг
посттрансляционные модификации (ПТМ)
Количественный
анализ (относительный и абсолютный)
оценка экспрессии
оценка ПТМ
Слайд 6
Посттрансляционные модификации
Белки не являются статичными в клетке и
подвергаются различным обратимым и необратимым модификациям:
Фосфорилирование
Гликозилирование
Убиквитинирование
S-нитрозилирование
Метилирование
N-ацетилирование
Связывание с липидами
Слайд 7
Посттрансляционные модификации
Фосфорилирование – наиболее частый механизм регуляции функций
белка и передачи сигналов путём изменения конформации (влияет на
клеточный цикл, рост, апоптоз и сигнальные пути)
Гликозилирование – наиболее разнообразный механизм (обеспечивает фолдинг, присоединение фосфолипидов, влияет на транспорт белков, адгезию клеток, взаимодействие белков/белок-лиганд, растворимость)
Убиквитинирование – образование пептидной связи белок-убиквинтин (полиубиквитинирование распознаётся протеасомами и ведёт к деградации белка)
Слайд 8
Посттрансляционные модификации
S-нитрозилирование – присоединение NO к цистеину (влияет
на сигнальные механизмы)
Метилирование (повышает гидрофобность и снижает отрицательный заряд,
метилирование гистонов вляет на доступность ДНК для транскрипции)
N-ацетилирование – замена метионина на ацетильную группу – 80-90% белков, ацетилирование лизина в гистонах (регуляция транскрипции – гипоацтелирование гистонов)
Связывание с липидами обеспечивает доставку в органеллы, везикулы и через клеточную мембрану.
Слайд 9
«Мокрые» методы протеомики
Электрофорез
SDS-PAGE
Native-GE
2D-PAGE
Капиллярный ЭФ
Блоттинг
Иммунопреципитация и обработка ферментами
Жидкостная хроматография
Масс-спектрометрия
(LC-MS(/MS), MALDI-TOF-MS(/MS), ...)
Слайд 10
Пример рабочего процесса
Эксперимент
Выделение тотального белка
Разделение белков / пептидов
Детекция
Обработка
данных
Слайд 11
Пример рабочего процесса
Эксперимент
Выделение белка
Изоэлеткрофокусировка
SDS-PAGE
Обработка трипсином (tryptic digest)
Масс-спектрометрия MALDI-TOF-MS
Идентификация белков в Mascot
Слайд 12
Масс-спектрометрия в протеомике
МС позволяет получить сведения о массе
и фрагментации полипептидов.
Детекция
нетаргетная TOF/TOF, Orbitrap, Fourier transform MS.
таргетная: QQQ,
Ion trap, QTOF, Q Trap.
С помощью МС можно осуществить качественный и количественный анализ:
мечение стабильными изотопами
изобарные (масс-тандемные) метки
внутренние стандарты и SRM/MRM
Слайд 13
Работа с данными масс-спектрометрии
Оценка предварительных данных (pI, Mw,
...)
Поиск пиков
Идентификация пептидов и белков
Оценка значимости, поиск и объяснение
различий
Слайд 15
Поиск пиков
Поиск пиков
Определение
m/z, Tr
Формирование
файла со
списком пиков
MZmine2
mMass
Слайд 16
Идентификация пептидов
Peptide Mass Fingerprint – полипептид даёт определенный
набор пиков, отвечающий массам его фрагментов.
Mascot (http://www.matrixscience.com/)
MzJava
PepFrag
xQuest
Моделирование спектров
mProphet
Слайд 17
Peptide Mass Fingerprint
Сырые данные должны быть переведены в
список пиков.
Параметры поиска должны быть оптимизированы с использованием стандартов
(BSA).
Необходимо учитывать возможность контаминации.
Необходимо указывать конретный используемый для лизиса фермент.
Необходимо оценивать достоверность результатов.
Слайд 18
Инструменты протеомики
Коллекции инструментов:
http://www.expasy.org/tools/
http://www.ms-utils.org/wiki/pmwiki.php/Main/SoftwareList
Слайд 19
Пример рабочего процесса
Эксперимент
Выделение белка
Изоэлеткрофокусировка
SDS-PAGE
Обработка трипсином (tryptic digest)
Масс-спектрометрия MALDI-TOF-MS
Обработка данных в Mascot
Слайд 20
Моделирование структуры белка
SwissModel (https://swissmodel.expasy.org/)
выравнивание белков
построение модели по наиболее
близкому белку
FoldX
оптимизация структуры белка
оценка влияния мутаций и изменения условий
на стабильность белка.
Предел – примерно 30% идентичности.
Слайд 21
Моделирование структуры белка de novo
Предсказание вторичной стурктуры по
первичной и третичной по вторичной.
Предсказание вторичной структуры и поиск
по базам данных о фолдинге для схожих структур.
Прдсказание третичной структуры по оценке энергии взаимодействия аминокислот в зависимости от "скелета", моделирующего определённую конформацию.
