Презентация на тему Введение в высокопроизводительное секвенирование

ДНК открыта в СО РАН

NGS
Ключевые понятия NGS
Этапы подготовки и проведения высокопроизводительного секвенирования
«Агентство Химэксперт»

последовательность принципиально большей общей протяженности за один рабочий цикл

по сравнению с методами секвенирования предыдущего поколения (методы Сэнгера и Максама-Гилберта)

перекрывающихся фрагментов исходной молекулы.
Next-generation sequencing секвенирование нового поколения
секвенирование следующего поколения
высокопроизводительное

секвенирование

ER Mardis - Nature, 2011

транскриптомов
Секвенирование экзомов
Полногеномное секвенирование
Технология NGS позволяет проводить:

Дмитрий d.korostin@gmail.com ИОГен РАН
ДНК нарезается на фрагменты определенной длины

К

ним лигируются адаптеры

Амплификация каждого отдельного фрагмента в изолированных от других условиях

Анализ последовательности амплифицированных клонов ДНК

из коротких чтений? Практические советы. Науменко С.А.
http://gcat.davidson.edu/phast/
- Это

сколько раз в среднем нуклеотид генома покрыт ридами

genome assembly.
Comparison between a german E. coli outbreak

strain and reference strain E. Coli 559889

Собранный
геном

Сборка последовательности - выравнивание и слияние фрагментов более длинной последовательности ДНК для восстановления исходной последовательности

de novo сборка выполняется в случае, если отсутствует референсная последовательность для сравнения

При гибридной сборке можно использовать элементы близкородственной или частично референсной последовательности

программе MIRA

в реконструированной последовательности

Позволяет оценить % покрытия генома

Высокое покрытие исправляет

ошибки при сборке

Типичное желательное покрытие генома 30x

N = Кол-во прочтений
L = средняя длина прочтений
G = Длина прочитываемого участка (генома)

Genomes Using Blacklight
Philip Blood

коротких чтений? Практические советы. Науменко С.А.
http://www.discoveryandinnovation.com/BIOL202/notes/lecture25.html
N50 показывает качество

сборки
Скаффолды располагают по убыванию длины
Суммируют длину, начиная с самого большого скаффолда
На каком скаффолде покроем половину генома?
Длина этого скаффолда называется N50.

такой же или большей длины составляют 50% всех нуклеотидов

в сборке

Контиги, отсортированные по длине

(Whole genome);
часть геномной ДНК (Targeted Enrichment);
набор ПЦР-продуктов

(ампликонов);
кДНК (RNA-Seq);
иммунопреципитированный хроматин (ChIP-Seq) и т.д.

на магнитных частицах
Подготовка матрицы

матрицы

микрочипе при последовательном удлинении олигонуклеотидной затравки ДНК-полимеразой
Секвенирование

один за другим на чип
После встраивания нуклеотида в цепь

происходит отщепление протона и изменение pH в ячейке

Чувствительный слой регистрирует изменение pH

Сенсор переводит химический сигнал в цифровой

Изменение напряжения пропорционально количеству встроенных нуклеотидов

Измерение напряжения

1

2

3

4

5

https://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Sequencing/Semiconductor-Sequencing/Semiconductor-Sequencing-Technology/Ion-Torrent-Technology-How-Does-It-Work.html

Cхематическое изображение
поперечного сечения одной ячейки на чипе

о том, сколько нуклеотидов инкорпорирует во время одной подачи

нуклеотида
Отсутствие пика при подачи нуклеотида говорит об отсутствии данного нуклеотида в матрице

Ионограмма

секвенирования.
Простые опции для показа метрики анализа, доступные для понимания

тех, кто не является экспертом в области биоинформатики.
Точность при определении гомополимеров.
Различные приложения.
Отправка данных через «облако» по сети.
Ion Reporter
Анализ данных через «облако», аннотация и составление отчёта о результате.

Анализ данных

Johan Rung, Alvis Brazma, John C. Marioni. 2012
Mappers time

line (since 2001)

DNA mappers are plotted in blue,
RNA mappers in red,
miRNA mappers in green,
bisulte mappers in purple.

популяциях
PGP: personal genome project, изучение вклада наследственности и среды

в проявление различных признаков; секвенирование геномов добровольцев, согласных предоставить личную информацию
GEUVADIS Genetic European Variation in Disease: медицинскя интерпретация сиквенсовых данных для разных моно- и полигенных заболеваний; на основе RNA-Seq и ExonSeq
ESGI: European Sequencing and Genotyping Infrastructure: организация NGS инфраструктуры для европейского научного сообщества
IHEC: International Human Epigenome Consortium: характеристика эпигенома человека, ~1000 образцов

Раковые программы
выявление диагностичеких маркеров, анализ и выбор лечения
ICGC: International Cancer Genome Consortium: подпрограммы по разным видам рака (напрмер, рак простаты, детские опухоли мозга)
Treat 1000: разные виды рака
OncoTrack: рак прямой кишки
CAGEKID: рак почки
Treat 20: меланома

Масштабное применение NGS

Высокопроизводительное секвенирование и его применение. Коростин Дмитрий d.korostin@gmail.com ИОГен РАН

подход
большие геномы: ресиквенс с анализом небольших перестроек был хорош

всегда, сиквенс de novo и анализ больших перестроек совершенствуются на глазах
классификация организмов по молекулярным признакам
сиквенс определенных областей генома: обогащение: функциональный экзом (~5%) и произвольно выбранных областей

Геномная архитектура
позиция нуклеосом
трёхмерная структура генома: 3C (hypothesis-free) и 5C (высокопроизводительный анализ)

Эпигенетика
метилирование: сиквенс после бисульфидной обработки или ChIP-Seq
возможно, машины третьего поколения смогут определять модификации напрямую

Взаимодействие нуклеиновых кислот с белками
ChIP-Seq
полногеномный неселективный анализ мест посадки белков
гиперчувствительность к нуклеазам, FAIRE-Seq
анализ специфичности взаимодействия (напрямую), поиск консенсусных последовательностей

Геном

Высокопроизводительное секвенирование и его применение. Коростин Дмитрий d.korostin@gmail.com ИОГен РАН

РНК, антисенс-транскрипция и т.д.
чувствительность: при адекватной организации эксперимента, можно

быть уверенным, что замечены все действующие РНК

RNA-Seq позволяет
определять как относительный, так и абсолютный уровни экспрессии
аннотировать новые и уточнять аннотацию известных генов
смотреть отдельно ядерную, цитоплазматическую, ассоциированную с рибосомами (в цитоплазме и на мембранах) и т.п. РНК
выявлять присутствие в образце микроорганизмов и вирусов

Чувствительность

Транскриптом

Высокопроизводительное секвенирование и его применение. Коростин Дмитрий d.korostin@gmail.com ИОГен РАН

эволюционные нововведения с появлением в геноме новых функциональных участков,

типа проект «Origins of Multicellularity»
выявить механизмы и движущие факторы эволюции для разных эпох
разобраться, что отличает нас от ближайших и дальних родичей

Внутривидовое сравнение геномов

причина тонких различий в реакции на факторы окружающей среды (болезни) и поведении
факторы, определяющие сложные полигенные признаки (рост, вес, предрасположенность к распространенным болезням)
механизмы рекомбинации
факторы отбора в «историческое» время
история расселения человечества

Сравнительный функциональный анализ

Высокопроизводительное секвенирование и его применение. Коростин Дмитрий d.korostin@gmail.com ИОГен РАН

Германии
анализ симбиотических организмов: микробиом

Предрасположенность к болезни →

генотип
GWAS, вовлеченные гены, молекулярные причины болезни, выбор мишени
редкие болезни, семейный анализ: «быстрый» тест сиквенсом кодирующих последовательностей
иммунный репертуар B- и T-клеточных рецепторов: подверженность болезням, ответ на вакцинацию
неинвазивная и пренатальная диагностика по ДНК в крови

Болезнь → профиль экспрессии
классификация опухолей, тонкий и/или ранний диагноз
спектр мутагенеза – причина опухолеобразования

Медицина

Высокопроизводительное секвенирование и его применение. Коростин Дмитрий d.korostin@gmail.com ИОГен РАН

список онкогенов
тестирование лекарств на клеточных линиях
тонкая диагностика и выработка

«стандартных» способов лечения
неинвазивная диагностика (посттреатмент): опухолевые ДНК и клетки в крови

Медицина

Высокопроизводительное секвенирование и его применение. Коростин Дмитрий d.korostin@gmail.com ИОГен РАН