Презентация на тему Молекулярно-генетические методы диагностики наследственных заболеваний

последовательности ДНК (мутации и их типы). Прямые методы отличаются точностью, достигающей

почти 100 %.

Должна быть известна цитогенетическая локализация гена, ответственного за развитие наследственного заболевания.
Должна быть известна его нуклеотидная последовательность.

исследуемым геном определенного полиморфного локуса (маркера), с помощью которого

можно производить маркировку как мутантных, так и нормальных аллелей и проанализировать их передачу в поколениях.
Используется при заболеваниях, ген которых достаточно точно картирован, т.е. локализован в конкретном узком участке определенной хромосомы. 

разрушение и экстрагирование белков
Осаждение молекул ДНК
Растворение ДНК в буферном

растворе

нарабатывать «in vitro» определенный участок молекулы ДНК практически в

неограниченных количествах.

участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in

vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям.
С помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований.

заболеваний (наследственных, инфекционных)
HLA-типирование
Установление отцовства
Клонирование генов
Выделение

новых генов
Как этап других методов

скорость получения результата

жидкости
моча, кал
мокрота, слизь
другие биологические выделения,

биоптаты

в температуре плавления праймеров - не более 6 градусов
Ц+Г

должно быть 50-60 %
Для улучшения качества отжига рекомендуется подбирать праймеры так, чтобы последние несколько нуклеотидов 3' - конца праймера содержали GC-основания
Отсутствие внутренней вторичной структуры (праймеры не должны быть само- и взаимнокомплиментарными)
Отсутствие комплементарности между 3'-концами (чтобы не образовывалось праймер-димеров)
Область отжига праймеров должна находиться вне зон мутаций, делеций или инсерций в пределах видовой или иной, взятой в качестве критерия при выборе праймеров, специфичности.

приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с

точностью не менее 0,1 °C. Современные амплификаторы позволяют задавать сложные программы, в том числе с возможностью «горячего старта», и последующего хранения амплифицированных молекул при 4 °C.

°C (или до 98 °C, если используется особенно термостабильная

полимераза) на 0,5—2 мин., чтобы цепи ДНК разошлись. На этой стадии разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Иногда перед первым циклом (до добавления полимеразы) проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2—5 мин. для полной денатурации матрицы и праймеров. Такой приём называется горячим стартом, он позволяет снизить количество неспецифичных продуктов реакции.

чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Температура отжига

зависит от состава праймеров. Время стадии — 0,5—2 мин. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре).

праймер в качестве затравки. Полимераза начинает синтез второй цепи

от 3'-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы в направлении от 3' к 5'. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72 °C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7-10 мин.

каждый из которых состоит из 3х стадий.

транскрипцией
Асимметричная ПЦР
Количественная ПЦР в реальном времени
Метод

молекулярных колоний
Геликазно-зависимая амплификация
ПЦР длинных фрагментов
Случайная амплификация полиморфной ДНК
Мультиплексная ПЦР
 

параметрам, как размеры (или молекулярная масса), пространственная

конфигурация, вторичная структура и электрический заряд.

Агарозный гель
Полиакриламидный гель

градиентный гель - электрофорез

для выявления таких мутаций, как замена оснований, малые инсерции

и делеции, различные перестройки и наиболее пригоден для анализа относительно коротких (200-300 п.н.) фрагментов ДНК.

а также инсерции и делеции. 

Амплификация фрагментов
Денатурация
Ренатурация

градиентом денатурирующих.
Миграция продолжается до тех пор, пока ДНК-дуплексы не

достигают в геле точки плавления и не разделяются, после чего миграция фрагментов останавливается.
Однонуклеотидные различия в нормальной и тестируемой ДНК выявляются по различной электрофоретической подвижности в геле. 

эндонуклеазной активностью и участвующие в системе распознавания и защиты

«своих» и уничтожения чужеродных ДНК in vivo.
Длина распознаваемого участка варьирует от 4 до 12 нуклеотидов.
Рестриктаза разрезает молекулу ДНК на фрагменты в сайтах рестрикции.
Чем больше сайтов рестрикции, тем больше образуется рестрикционных фрагментов.
Образующиеся в результате рестрикции фрагменты ДНК могут быть упорядочены по длине путем электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле в зависимости от их молекулярной массы. Зная молекулярную массу фрагментов, можно определить физическое расстояние между сайтом рестрикции и концами исходного фрагмента ДНК, что является основой метода, получившего название физического картирования.

рестриктаз, делают эти участки ДНК нечувствительными к действию ферментов.

Это может быть легко обнаружено по изменению длины рестрикционных фрагментов ДНК.
Этапы:
Выделение ДНК
Амплификация
Рестрикцию специфической эндонуклеазой
Электрофоретическое разделение образующихся фрагментов ДНК
Идентификацию этих фрагментов путём блот-гибридизации по Саузерну

установить последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК. 

В результате секвенирования получают

формальное описание первичной структуры линейной макромолекулы в виде последовательности мономеров в текстовом виде. Размеры секвенируемых участков ДНК обычно не превышают 100 - 1000 пар нуклеотидов.

in vitro с остановкой синтеза на заданном основании путем

присоединения дидезоксинуклеотида. Дидезоксинуклеотид лишен гидроксильных групп при атомах сахарного кольца не только в 2'-, но и в 3'-положении, что делает его неспособным формировать фосфодиэфирную связь со следующим нуклеотидом.

Для проведения секвенирования необходимы:
1) секвенирующий праймер (искусственно синтезированная олигонуклеотидная последовательность, комплементарная определенному участку исходной молекулы ДНК)
2) набором из четырех дезоксинуклеотидов dATP, dCTP, dGTP и dTTP, один из которых изотопно меченный
3) один из четырех дидезоксинуклеотидов (ddATP, ddCTP, ddGTP и ddTTP)
4) ДНК-полимераза

синтез ДНК
3) денатурация полученных продуктов формамидом (в результате образуются

уникальные различающиеся по длине олигонуклеотидные последовательности, содержащие праймер)
4) электрофорез в полиакриламидном геле на четырех дорожках (по числу типов нуклеотидов)
5) анализ результатов на радиоавтографе. На большинстве радиоавтографов можно четко различить 250—350 полос, т.е. прочитать последовательность в 250-350 п.н.

кусочки подходящего размера (ок. 800 пар оснований), используя пневматическое

устройство под названием небулайзер. Концы ДНК зачищаются и два уникальных адаптера присоединяются к фрагментам.
Амплификация фрагментов
Синтез новых фрагментов ДНК на одноцепочечных ДНК-библиотеках, которые выполняют роль матрицы. Нуклеотиды встраиваются в новую цепь в определенном порядке, соответствующем матричной цепи, который записывается в цифровом виде. После включения в цепь каждого последующего нуклеотида прибор регистрирует сигнал.
Анализ полученных данных

между искусственно созданным ДНК-зондом и комплементраной ему нуклеотидной последовательностью

ядерной ДНК. 
Объектом исследования являются уникальные нуклеотидные последовательности конкретной хромосомы или ее отдельного участка.     
FISH метод позволяет оценить генетический статус отдельной клетки и выявить, к примеру, несколько этиопатогенетически значимых аномальных клеток среди тысяч других с нормальным генотипом.

Данные зонды используются для идентификации имеющейся короткой последовательности выделенной

ДНК, которая используется для приготовления меченого зонда и его последующей гибридизации с набором хромосом,
альфоидные или центромерные зонды-повторы представляют собой повторяющиеся последовательности центромерных областей хромосом. С их помощью каждая хромосома может быть окрашена в различный цвет, что позволяет быстро определить число хромосом и отклонения от нормального их числа,
зонды на всю хромосому являются набором небольших зондов, комплементарных к отдельным участкам хромосомы, но в целом покрывающими всю ее длину. Используя библиотеку таких зондов можно "раскрасить" всю хромосому и получить дифференциальный спектральный кариотип индивида. Данный тип анализа применяется для анализа хромосомных аберраций, например транслокаций, когда кусочек одной хромосомы переносится на плечо другой.

обработка Препарат обрабатывается протеазами, чтобы исключить присутствие белков, которые затрудняют

гибридизацию.
3. Нанесение ДНК-зонда на препарат и последующая денатурация. Для того, чтобы денатурировать зонд и ДНК образца, их обрабатывают формамидом и нагревают до температуры около 85-90°С.
4. Гибридизация. После денатурации препарат охлаждают до определенной температуры (37°С в случае клинических исследований) и инкубируют во влажной камере в течение нескольких часов.
5. Промывка. После того, как гибридизация завершена, необходимо отмыть несвязавшиеся зонды, которые, в противном случае, создадут фон, затрудняющий оценку результатов FISH-анализа. Для промывки обычно используют раствор, содержащий цитрат и хлорид натрия (SSC).
6. Контр-окрашивание. При помощи флуоресцентных красителей (DAPI - 4,6-диамидин-2-фенилиндол; йодид пропидия) проводится окраска всей ядерной ДНК.
7. Анализ результатов при помощи флуоресцентного микроскопа.