Слайд 2
ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА У БАКТЕРИЙ
ДНК = нуклеоид (бактериальная
«хромосома») – кодирует жизненно важные признаки
внехромосомные факторы наследственности:
- Плазмиды,
- Транспозоны,
- IS-последовательности
кодируют признаки, дающие преимущество.
Слайд 3
Единицей наследственности является ГЕН = участок ДНК, в
котором зашифрована последовательность аминокислот в полипептидной цепочке, контролирующая отдельный
признак особи.
Слайд 4
Гены:
Структурные = обуславливают синтез определенного белка (фермента), при
мутации образуется белок измененного состава,
Ген-регулятор = определяет синтез белковой
молекулы-репрессора, подавляющего деятельность структурных генов в отсутствии субстрата,
= при наличии субстрата репрессор временно инактивируется и структурные гены, освобожденные от его влияния, начинают функционировать,
Ген-оператор = посредник между геном-регулятором и структурными генами,
= расположен рядом со структурными генами.
Слайд 5
Совокупность генов, сосредоточенных в нуклеоиде («Хромосоме») бактерий называется
генотип.
Фенотип – совокупность всех признаков микроорганизма, сформировавшаяся в результате
взаимодействия генотипа с внешней средой.
Генетические элементы, способные самостоятельно реплицироваться наз-ся репликонами = ДНК и плазмиды.
Слайд 7
ДНК («хромосома»)
двухцепочечная кольцевая молекула,
сод-т до 5
тыс. генов,
имеет молекулярную массу 1,7-2,8х109 дальтон,
включает 3-5х106
пар оснований,
имеет гаплоидный набор генов,
расположена в цитоплазме клетки в многократно свернутом и плотно упакованном виде,
содержит гены, обуславливающие жизненно-важные для бактерий признаки.
Слайд 8
Генетическая карта
= это схематическое изображение всех генов микроорганизма.
Гены, отвечающие за определенный признак, обозначают строчными буквами латинского
алфавита со знаком + (например, гистидиновый ген – his+), отсутствие гена знак – «–»
Слайд 9
ВНЕХРОМОСОМНЫЕ ФАКТОРЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ
автономные – являются репликоном
плазмиды
неавтономные - реплицируются
только в составе репликона (нуклеоида или плазмиды):
Транспозоны,
IS-последовательности,
умеренные фаги.
Слайд 10
ВСТРАИВАНИЕ В НУКЛЕОИД ВНЕХРОМОСОМНЫХ ФАКТОРОВ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ
в гомологичных участках
Плазмиды,
Умеренные
фаги.
в любых участках
Транспозоны,
IS-последовательности.
Слайд 11
ПЛАЗМИДЫ
внехромосомные факторы наследственности у бактерий,
двухцепочечные молекулы ДНК,
несут
40-50 генов,
не являются жизненно важными для бактерии,
обусловливают
признаки, позволяющие лучше приспособиться к условиям обитания.
возможные состояния
автономное (в цитоплазме)
интегрированное (в нуклеоиде). В этом случае плазмида называется ЭПИСОМА.
Слайд 12
ПЛАЗМИДЫ
функции
регуляторная – компенсирует нарушение функции ДНК нуклеоида,
кодирующая –
вносит в генотип новую информацию.
содержание tra-оперона
Трансмиссивные (конъюгативные) - содержат
Нетрансмиссивные
(неконъюгативные) - не содержат
Слайд 13
ПЛАЗМИДЫ
контроль репликации плазмид со стороны нуклеоида
строгий (делятся синхронно
с нуклеоидом) ⇒ 1-2 копии на клетку (большие плазмиды),
ослабленный
(делятся чаще нуклеоида) ⇒ 10-30 копий на клетку (малые плазмиды).
совместимость
> 20 групп несовместимости, объединяющих родственные плазмиды.
Слайд 14
ФУНКЦИИ TRA-ОПЕРОНА
детерминирует образование конъюгативных пилей,
мобилизирует на перенос:
саму конъюгативную
плазмиду (F+),
другую, неконъюгативную, плазмиду (RTF),
участок нуклеоида (Hfr).
Слайд 15
Фенотипические признаки, сообщаемые бактерии плазмидами
устойчивость к антибиотикам,
образование
бактериоцинов,
продукция факторов патогенности,
способность к синтезу антибиотиков,
расщепление сложных органических веществ,
образование
ферментов рестрикции и модификации.
Слайд 16
Наиболее изучены плазмиды:
F- плазмида = половой фактор –
контролирует синтез половых ворсинок,
= бывает: - автономной→ бактерия
наз-ся F+ штаммом
- интегрированной → Hfr – штамм,
= конъюгативная
R-плазмида (resistance - устойчивость) – обусловливает синтез ферментов, разрушающих антибиотики, сульфаниламиды и др., в результате бактериальная клетка становится устойчивой к лекарственным препаратам,
- в 1 плазмиде м.б. 3-10 детерминант устойчивости.
Слайд 17
Наиболее изучены плазмиды:
Col-плазмиды - обусловливают синтез бактериоцинов (
= белки, задерживающие рост других штаммов бактерий того же
вида). Бактерии, несущие такие плазмиды, обладают преимуществом при заселении биотопа.
Плазмиды патогенности – определяют:
синтез энтеротоксинов (Ent-)
ферментов патогенности (Hly-),
поверхностного антигена вирулентности ( Vir-).
Плазмиды биодеградации – несут информацию об утилизации органических соединений, которые бактерии используют в качестве источника углерода и энергии.
Слайд 18
ТРАНСПОЗОНЫ
определение
= нуклеотидные последовательности (от 2 000 до 20000
пар нуклеотидов), способные менять место своей локализации в молекуле
ДНК и мигрировать из одной молекулы ДНК в другую.
состояние в бактериальной клетке
интегрированное в репликон (реплицируется вместе с ним),
автономное (замыкается в кольцо и не реплицируется).
Слайд 19
ТРАНСПОЗОНЫ
Состав:
особые концевые структуры, которые отличают транспозон от др.
фрагментов ДНК (маркеры транспозона),
гены транспозиции,
гены, детерминирующие синтез
- токсинов,
- ферментов, обеспечивающих устойчивость к антибиотику,
- белков, обеспечивающих др. признаки.
Слайд 20
IS-ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
определение
=вставки нуклеотидных последовательностей (порядка 1 000 пар нуклеотидов),
содержат
только гены, необходимые для собственного перемещения:
= ген,
кодирующий фермент транспозазу – обеспечивает исключение IS-элемента из ДНК и его интеграцию в новый локус,
= ген, обуславливающий синтез репрессора, регулирующего весь процесс перемещения,
не способны реплицироваться самостоятельно.
Слайд 21
IS-ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
отличия от транспозонов
содержат только гены транспозиции,
не обнаружены в
свободном состоянии.
Слайд 22
Функции IS-ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
координация взаимодействия внехромосомных факторов наследственности между
собой и с бактериальной хромосомой для обеспечения их рекомбинации,
регуляторная - регуляция транскрипции генов путём их «включения/выключения»,
индукция мутаций - инверсии, дупликации на протяжении 5-9 пар нуклеотидов.
Слайд 23
Изменчивость микроорганизмов
Модификационная = ненаследуемая,
Генотипическая = наследуемая.
Слайд 24
Изменчивость микроорганизмов
Модификационная = ненаследуемая, фенотипическая, адаптационная,
– возникает
как приспособительная реакция организма на условия среды,
-
встречаются часто и касаются одновременно всех особей популяции,
- вскоре утрачиваются.
Слайд 25
МОДИФИКАЦИИ У БАКТЕРИЙ
Фенотипические изменения у бактерий
не сопровождаются изменениями
первичной структуры ДНК,
они выражаются:
- в изменении формы и
размеров микробной клетки,
- морфологии колоний,
- биохимических и антигенных признаков.
Слайд 26
Изменчивость микроорганизмов
Наследуемая = генотипическая
– изменения
затрагивают лишь отдельные клетки,
– приобретенные признаки передаются
потомству и в силу лучшей адаптации к условиям существования измененные клетки с новыми признаками постепенно вытесняют клетки исходного штамма.
Изменения генома могут происходить в результате мутаций и рекомбинаций.
Слайд 27
МУТАЦИИ У БАКТЕРИЙ
Определение
Изменения в первичной структуре
ДНК, которые выражаются в наследственно закреплённой утрате или изменении
какого-либо признака (-ов).
Слайд 28
Классификация мутаций по происхождению
спонтанные – трудно или невозможно
связать с действием определённого фактора (мутагена)
ошибки в работе ДНК-полимеразы
при репликации ДНК
инсерционные – при встраивании в нуклеоид внехромосомных факторов наследственности
индуцированные – в эксперименте под воздействием мутагена
Слайд 29
Классификация мутаций по количеству мутировавших генов:
Генные затрагивают один
ген:
- замена одной пары азотистых оснований другой,
- вставка
дополнительных нуклеотидов,
- утрата «-«→ замена одной аминокислоты другой или нонсенс-мутация = бессмысленная,
Хромосомные затрагивают несколько генов.
Важную роль играют мигрирующие генетические элементы: Is- последовательности и Tn- транспозоны = биологические мутагены.
Слайд 30
Хромосомные мутации
делеции – потеря гена,
инверсия – поворот
участка хромосомы или нарушение порядка гена,
дупликации – удвоение
гена,
транспозиция – перемещение гена.
Слайд 31
Классификация мутаций по направленности
прямые – потеря или изменение
признака,
обратные (реверсии) – восстановление признака:
истинные – восстанавливается и фенотип
и генотип,
супрессорные – восстанавливается только фенотип.
Слайд 32
SR-ДИССОЦИАЦИИ
= появление в чистой культуре 2 видов бактериальных
клеток, которые отличаются по характеру образуемых колоний на твердой
питательной среде:
S-колонии – форма круглая, поверхность гладкая, чаще образуются при выделении от больного человека, бактериальные клетки характеризуются высокой вирулентностью,
R- колонии имеют неровные края, шероховатую поверхность.
Между ними м.б. переходные формы: О- мутные,
Д-карликовые.
Процесс диссоциации обычно протекает в одном направлении: от S- к R-.
Слайд 33
SR-ДИССОЦИАЦИИ
механизм
Это инсерционная мутация, приводящая к утрате генов, контролирующих
синтез полисахаридных звеньев ЛПС наружной мембраны клеточной стенки
биологическое значение:
R-формы
более устойчивы к физико-химическим факторам внешней среды,
S-формы более устойчивы к фагоцитозу и действию антител.
Значительно усложняют выделение и идентификацию чистой культуры.
Слайд 34
МУТАГЕНЫ
Мутагены – факторы, вызывающие мутации.
Различают:
физические мутагены –
ультрафиолетовые лучи, ионизирующие излучения, магнитные поля, температура,
химические – пероксидазы,
акридиновые красители, азотная кислота,
биологические – Is-последовательности и Tn- транспозоны, фаги, антибиотики, фитонциды.
Слайд 35
МУТАГЕНЫ
Классификация по механизму действия:
аналоги азотистых оснований ⇨ замена
пар оснований,
акридиновые красители ⇨ выпадения или вставки оснований,
УФ, некоторые
продукты микробного метаболизма ⇨ нарушение работы ДНК-полимеразы ⇨ образование тиминовых димеров,
нитрозосоединения ⇨ множественный эффект («супермутагены»).
Слайд 36
РЕПАРАЦИИ
Определение
Процесс восстановления повреждённой ДНК ферментами репарационных систем
Различают 2
типа репарационных систем:
Система фотореактивации
Система темновой репарации.
Слайд 37
Система фотореактивации
УФ-лучи
⇩ мутация
тиминовые димеры
⇩
видимый свет
⇩
активация фермента репарация
⇩
расщепление димеров
Слайд 38
Этапы темновой репарации:
установление места повреждения ДНК
= эндонуклеаза,
«вырезание» поврежденного фрагмента = полимераза 1,
синтез
фрагмента по матрице сохранившейся нити ДНК – ДНК-полимераза 1 или III,
встраивание синтезированного фрагмента в молекулу поврежденной нити ДНК = лигаза
Слайд 39
Система темновой репарации
УФ-лучи
⇩
тиминовые димеры
⇩
темнота
⇩
Слайд 40
Система темновой репарации
обнаружение и нарезание повреждённого участка
(эндонуклеаза)
⇩
Слайд 41
Система темновой репарации
удаление повреждённого участка
(ДНК-полимераза I)
⇩
Слайд 42
Система темновой репарации
синтез на матрице второй нити ДНК
нового, не содержащего мутации, участка
(ДНК-полимераза I или III)
⇩
Слайд 43
Система темновой репарации
«вшивание» нового участка в цепь ДНК
(лигаза)
Слайд 44
Генетические рекомбинации
= перераспределение генетического материала родителей в потомстве,
обусловливающее комбинативную изменчивость организмов,
= взаимодействие между двумя геномами, которое
приводит к образованию рекомбинантной ДНК и формированию дочернего генома, сочетающего гены обоих родителей.
Они происходят при участии ферментов в пределах отдельных генов.
Слайд 45
Механизм рекомбинаций
клетки=доноры
⇩
передают информацию
⇩
клеткам-реципиентам
⇩
рекомбинат
генотип рекомбинанта =
генотип реципиента+ часть генотипа донора
Слайд 47
ВИДЫ РЕКОМБИНАТИВНОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ У БАКТЕРИЙ
Трансформация – непосредственная передача
генетического материала от донорской к реципиентной клетке
Конъюгация – передача
генетического материала от донорской к реципиентной клетке с помощью конъюгационных пилей
Трансдукция – передача генетического материала от донорской к реципиентной клетке с помощью дефектных бактериофагов.
Слайд 48
Трансформация
= способ передачи генетической информации путем внедрения свободной
ДНК донора в бактерию-реципиент
Трансформация эффективно происходит только между
бактериями одного вида, имеющими разный генотип.
Слайд 49
Трансформация
Клетки, способные принимать донорскую ДНК, называются компетентными.
Состояние
компетентности возникает в период роста клетки и совпадает с
концом логарифмической фазы.
Трансформирующей активностью обладают двунитевые фрагменты ДНК с молекулярной массой не менее 0,5-1х106 .
Слайд 50
Процесс трансформации состоит из фаз:
адсорбция ДНК донора на
клетке-реципиенте,
проникновение ДНК внутрь клетки-реципиента с последующей деспирализацией,
соединение одной нити
ДНК с гомологичным участком хромосомы реципиента.
Слайд 52
Конъюгация
– перенос генетического материала из клетки-донора в клетку
реципиента при тесном контакте.
Донорами генетического материала являются клетки,
несущие F-плазмиду.
Бактериальные клетки, не имеющие F-плазмиды, являются реципиентами.
Слайд 53
Конъюгация
2 вида конъюгации:
Если F-плазмида автономна→ бактерия наз-ся F+
штаммом
2.Если F-плазмида интегрирована в ДНК →
Hfr –
штамм
Слайд 54
1 Если F-плазмида автономна:
1. Прикрепление клетки донора к
реципиенту с помощью половых ворсинок.
2. Между клетками образуется
конъюгационный мостик, через который из клетки-донора в клетку-реципиент передается F-плазмида:
2.1. tra-оперон кодирует белок, который в точке О разрывает одну цепь плазмиды и ковалентно связывается с 5, концом,
-2.2. линейная цепь переносится в клетку-реципиент, кольцевая нить остается в клетке-доноре,
Слайд 55
Схема конъюгации у бактерий (если F-плазмида автономна)
Слайд 56
1 Если F-плазмида автономна:
2.3.
белок способствует замыканию линейной нити в клетке-реципиенте,
2.4.
одноцепочечные нити достраиваются до двухцепочечных в клетке-доноре и реципиенте.
→ реципиент становится донором!!!
Слайд 57
Схема конъюгации у бактерий (если F-плазмида автономна)
Слайд 58
2.Если F-плазмида встроена в хромосому бактерии = Hfr-штамм:
Происходит разрыв одной нити ДНК при участии эндонуклеазы в
точке О, расположенной в месте интеграции F-плазмиды.
Проксимальный конец ДНК через конъюгационный мостик проникает в клетку-реципиент и сразу же достраивается до двунитевой структуры.
Оставшаяся в клетке донора нить является матрицей для синтеза второй нити.
- передается не вся нить, а несколько генов, плазмида остается в донорской клетке → реципиент остается реципиентом
Слайд 60
Схема конъюгации Hfr-штамма
разрыв одной нити ДНК при
участии эндонуклеазы в точке О, расположенной в месте интеграции
F-плазмиды.
Слайд 61
Схема конъюгации Hfr-штамма
Проксимальный конец ДНК через конъюгационный
мостик проникает в клетку-реципиент и сразу же достраивается до
двунитевой структуры.
Слайд 62
Схема конъюгации Hfr-штамма
Двунитевой фрагмент ДНК встраивается в
геном клетки-реципиента;
Плазмида осталась в клетке-доноре (Hfr-штамм)
Слайд 63
Трансдукция
– передача генетического материала от одной
бактерии к другой при помощи фагов.
Различают:
1) общую
= неспецифическую трансдукцию
2) специфическую трансдукцию
3) абортивную
Слайд 64
Общая = неспецифическая трансдукция
– когда в клетку–реципиент вместе
с фаговой ДНК переносится любой ген донора.
При репродукции
фага в клетке любой случайный ген м.б. включен в состав фаговой частицы.
Перенесенный фагом фрагмент ДНК бактерии-донора способен включаться в гомологичную область ДНК клетки-реципиента путем рекомбинации.
Трансдуцирующий фаг является только переносчиком генетического материала от одних бактерий к другим, а сама фаговая ДНК не участвует в образовании рекомбинантов,
Слайд 65
Специфическая трансдукция
– фаг переносит специфические гены от бактерии-донора
к бактерии-реципиенту:
При выходе из ДНК лизогенной клетки-донора профаг
включает расположенные рядом гены, а часть генов профага остается в хромосоме бактерии → образуется дефектный трансдуцирующий фаг.
При взаимодействии трансдуцирующих фагов с клетками реципиентного штамма происходит включение гена бактерии-донора вместе с ДНК дефектного фага в хромосому бактерии-реципиента.
Слайд 66
Абортивная трансдукция
= принесенный фагом фрагмент ДНК бактерии-донора не
включается в хромосому бактерии-реципиента, а располагается в ее цитоплазме
и может в таком виде функционировать.
Во время деления бактериальной клетки-рекомбинанта принесенный фрагмент ДНК донора передается только одной из дочерних клеток и со временем исчезает.
Слайд 67
Генетическая рекомбинация
= обмен между гомологичными участками геномов
двух вирусов,
– чаще встречается у ДНК-содержащих вирусов,
- среди РНК
– у вирусов с фрагментированным геномом.
вирус 1 + вирус 2 ⇒ в одной клетке
вирус 1 гены вирус 2
Слайд 68
Генетическая реактивация
= обмен между геномами родственных вирусов, у
которых мутации произошли в разных генах → полноценный геном
вирус
1 + вирус 2 ⇒ в одной клетке
вирус 1 вирус 2
(инакт. гены 1, 2, 3) (инакт. гены 4, 5, 6)
вирус
(все гены 1 – 6 активированы)
Слайд 69
Комплементация = обмен, когда один из двух вирусов
в результате мутации синтезирует неполноценный белок.
Немутантный вирус восполняет
его отсутствие у мутанта, синтезируя полноценный белок.
Н-р, при культивировании аденовируса в клетках почек обезьян макака-резус аденовирус мог размножаться только в присутствии онкогенного вируса SV40
вирус 1 + вирус 2 ⇒ в одной клетке
вирус 1
белок
репродукция вируса 2
Слайд 70
Фенотипическое смешивание
при смешанном заражении двумя вирусами часть потомства
приобретает фенотипические признаки, присущие обоим вирусам при неизменности генотипа
Н-р,
при заражении клеток вирусами полиомиелита и Коксаки часть потомства имеет РНК одного вириона заключенную в капсид другого
Слайд 71
Фенотипическое смешивание
вирус 1 + вирус 2 ⇒ в
одной клетке
вирус 1
вирус 2
НК 1
капсид 2
Слайд 72
ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ В МЕДИЦИНСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ
Продукты, получаемые генно-инженерным способом
с помощью рекомбинантных штаммов бактерий
вакцины
гормоны
интерфероны
цитокины
Слайд 73
ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ В МЕДИЦИНСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ
Получение рекомбинантной вакцины для
профилактики гепатита В
встраивание гена вируса гепатита В, детерминирующего синтез
HBs-Ag в геном дрожжевой клетки
⇩
манифестация гена
⇩
синтез дрожжевой клеткой HBs-Ag
⇩
очистка HBs-Ag
⇩
вакцина, содержащая HBs-Ag, но не содержащая вирусных частиц или их фрагментов
Слайд 74
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ
процентное содержание Г+Ц
в бактериальном геноме
метод молекулярной гибридизации
полимеразная цепная реакция (ПЦР)
рестрикционный анализ
Слайд 75
МЕТОД МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ
Цель
Выявления степени сходства различных ДНК (при
идентификации микроорганизмов – сравнение ДНК выделенного штамма с ДНК
эталонного штамма)
Слайд 76
МЕТОД МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ
Принцип осуществления
исследуемая ДНК
⇩
нагрев в щелочной среде
⇩
расплетение
на две отдельные нити
⇩
закрепление одной из них на специальном
фильтре
⇩
помещение этого фильтра в р-р, содержащий радиоактивный зонд (одноцепочечную молекулу ДНК эталонного штамма, меченную радиоактивным изотопом)
⇩
понижение температуры
⇩
+ - восстановление двойной спирали
– - двойная спираль не восстанавливается
Слайд 77
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ
Цели
обнаружение в патологическом материале конкретного вида
микроорганизма без выделения чистой культуры
идентификация микроорганизмов
генотипирование микроорганизмов
Слайд 78
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ
Принцип осуществления
патологический материал или штамм микроорганизма
⇩
выделение
ДНК
⇩
нагрев
⇩
расплетение ДНК на две нити
⇩
добавление праймеров (участки ДНК,
комплементарные 3’-концам искомого гена)
⇩
охлаждение
⇩
связывание праймеров с комплементарными участками искомого гена
⇩
Слайд 79
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ
Принцип осуществления
⇩
добавление ДНК-полимеразы и нуклеотидов
⇩
нуклеотиды присоединяются
к 3’-концам праймеров
⇩
повторение циклов (30-80) – накопление (амплификация) искомого
гена
⇩
резкое нарастание (двукратное после каждого цикла) количества искомого гена
⇩
определение количества ДНК с помощью электрофореза
+ - количество ДНК увеличивается
– - количество ДНК не увеличивается
Слайд 80
При нагревании две комплементарные нити ДНК расходятся –
она плавится
Слайд 82
Рестрикционный анализ
Расщепление ДНК микроорганизмов на фрагменты при помощи
рестриктаз (эндонуклеаз),
От бактерий выделено 175 рестриктаз,
Известно 80 сайтов, где
происходит разрыв,
В ДНК микроорганизма содержится определенное количество участков узнавания,
Под действием рестриктаз образуется конкретное количество фрагментов ДНК разного размера = РЕСТРИКЦИОННАЯ КАРТА
