Слайд 2
План лекції
Будова клітинного генетичного апарату.
Позахромосомні елементи спадковості.
Мутації.
Рекомбінації.
Основи
генної інженерії. Молекулярні біотехнології.
Генетика вірусів
Слайд 3
Історія розвитку молекулярної біотехнології
Слайд 4
Історія розвитку молекулярної біотехнології
Слайд 5
F. Crick i J. Watson –
відкривачі структури
ДНК
Слайд 7
Генетичний матеріал
у бактерій представлений:
хромосомою
позахромосомними елементами спадковості:
плазмідами
транспозонами
IS-елементами
Слайд 8
Плазміди можуть мати лінійну або кільцеву структуру, є
необов‘язковими компонентами мікробної клітини; здатні до самостійної реплікації.
Транспозони –
мігруючі гени, які мають здатність до переносу всередині клітини і одночасно містять гени резистентності до антибіотиків та іонів важких металів.
IS-елементи – мігруючі гени, які здатні до переносу всередині клітини з однієї ділянки ДНК на іншу.
Слайд 9
Мігруючі генетичні елементи
TGATC
ACTAG
GCGTATCG
CGCATAGC
TGATC
ACTAG
GCGTATCG
CGCATAGC
Гени для транспозиції
IS
IS
Гени лікарської стійкості та
ін.
5’
3’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
Прямі послідовності, що повторюються та
обмежують транспозон
Прямі послідовності, що повторюються
та
обмежують IS-елемент
Транспозон
Повторні кінцеві IS-елементи
Серцевинна область
IS (інсерційний, вставочний елемент)
Інвертовані повторні послідовності
Серцевинна область
Слайд 10
1. Координуюча: взаємодія транспозонів, плазмід, помірних фагів між
собою та хромосомою бактерії, забезпечуючи їх реплікацію.
2. Регуляторна: викликають
інактивацію генів, або служать промоторами (ділянки ДНК, які регулюють експресію клітинних генів).
3. Індукують мутації за типом делеції або інверсії
Функції IS-елементів:
Слайд 11
1. Регуляторна.
2. Кодуюча.
3. Індукують генні мутації за типом
делеції або інверсії.
4. Включення їх в реплікон супро-воджується абераціями
(структур-ними перебудовами) в ДНК цих репліконів; найчастіше проявля-ються інсерції, делеції, інверсії
Функції транспозонів:
Слайд 12
Класифікація плазмід
За розміщенням в клітині:
позахромосомні
інтегровані
За типом передачі:
кон’югативні (трансмісивні,
мають tra-ген)
некон’югативні
За ознаками, що обумовлюють певні властивості мікроорганізмів
Слайд 13
Сol – продукція коліцинів
HLy – продукція гемолізинів
Tol –
розщеплення толуолу, ксилолу
Ent – продукція ентеротоксину
Nif – зв’язування
азоту в K. pneumoniae
Ti – утворення пухлин у рослин
Плазміди біодеградації:
Саm – розщеплення камфари
Oct – розщеплення октану
Sal – розщеплення саліцину
Види плазмід:
Слайд 14
Функціональні властивості плазмід
Антибіотико
резистентність
пеніцилін
Загибель клітини
R-плазміда
пеніцилін
Розмноження антибітикоcтійких бактерій
фертильність
реципієнт
F-плазміда
F-пілі
вірулентність
Не продукує токсин
плазміда
вірулентності
токсин
донор
метаболізм
плазміда
метаболізму
Слайд 15
1. Регуляторна (якщо ген не здатний реплікуватись за
рахунок втрати його частини, плазміди вносять власний реплікон).
2. Кодуюча.
Функції
плазмід:
Слайд 16
високий темп втрати ознаки
збільшення темпів втрати ознаки під
впливом температури або хімічних сполук
спільна втрата або набуття декількох
ознак
Критерії плазмідної локалізації генів:
Слайд 17
За походженням: спонтанні;
індуковані.
За локалізацією: нуклеоїдні;
цитоплазматичні.
За кількістю генів, що мутували: генні;
хромосомні.
За величиною: великі (хромосомні);
малі (точкові).
Мутації
Слайд 18
інверсія
дуплікація
делеція
дислокація
Хромосомні мутації:
Слайд 19
делеція
інсерція (вставка)
заміна:
транзиція (пуринова основа
на пуринову, піримідинова – на піримідинову)
трансверзія (пуринова основа на піримідинову та навпаки)
Точкові мутації:
Слайд 20
1. Пряма мутація
2. Зворотна (обернена) мутація або реверсія
3.
Супресорна мутація (внутрішньогенна, позагенна). Веде до відновлення фенотипу, а
не генотипу.
4. Плейотропна мутація (зміна 2-ох і більше властивостей клітини)
5. Нонсенс-мутація (робить кодон нісенітним – не кодує жодної амінокислоти)
Мутації
Слайд 21
Мутагенні фактори
Фізичні:
1. УФО (λ-260 НМ) – найсильніша мутагенна
дія – утворюються димери тиміну, заміна основ
2. Іонізуюче опромінення
(рентгенівське, гамма-промені) - руйнування ДНК, летальний ефект
Біологічні: перекис водню
Слайд 22
Мутагенні фактори
Хімічні:
1. Азотиста кислота - дезамінує нуклеотиди
2. N-нітрозометилсечовина
– супермутаген, канцероген
3. Етилметансульфонат
4. Акридини – комплекс з ДНК,
інтеркаляція
5. Нітрозогуанідин
6. Аналоги основ (5-бромурацил, 2-амінопурин) – заміщення
7. Лікарські препарати (нітрофурани, деякі антибіотики
Слайд 23
Дія різних мутагенів на бактерії
Деякі фізичні й хімічні
фактори підвищують частоту мутацій. Ультрафіолетове
випромінювання та діоксин є
мутагенами й викликають утворення мутантів
(червоний колір).
Слайд 25
Властивості мікробів S-колоній:
Клітини нормальної морфології
Дифузне помутніння бульйону
У рухомих
видів є джгутики
У капсульних варіантів є капсули
Біохімічно більш активні
Повноцінні
в антигенному відношенні
У патогенних видів – вірулентні
Виділяються в гострому періоді хвороби
Чутливі до бактеріофагів
Менш чутливі до фагоцитозу
Слайд 26
Методи виявлення мутантів
За різницею в швидкості росту (посів
на мінімальне середовище; мутанти виростають)
Різна здатність до виживання
Метод реплік
Ледерберг
Слайд 27
Метод реплік для виявлення ауксотрофних мутантів
Повноцінне
середовище
Мінімальне середовище
(ауксотрофи
не ростуть)
Слайд 28
Світлова репарація –
Репарація тимінових димерів
Гуанін
Цитозин
Тимін
Аденін
Ковалентний
звґязок
(тиміновий димер)
розщеплення тимінових димерів у присутності
світла.
Слайд 29
Темнова репарація
1. Деградація прилеглих до пошкодженої ділянок ДНК
2.
Вирізання за допомогою рестриктаз пошкоджених ділянок
3. Відновлення видаленої ділянки
за допомогою ферменту ДНК залежної ДНК-полімерази
4. Зшивання ДНК- лігазами
Слайд 30
SOS-реактивація
При множинних ушкодженнях ділянки з мутаціями переводяться в
неактивний стан, а їх роль виконує неушкоджена ділянка ДНК.
Слайд 31
ТРАНСФОРМАЦІЯ
Бактеріальна
хромосома
Фрагменти ДНК
Інтеграція ДНК
в хромосому
Деградація
А
В
ДНК плазміди
Бактеріальна
хромосома
Слайд 32
Трансформація (досліди Грифітса, 1928; Евері Мк Леода і
Макарті, 1944)
Слайд 33
ТРАНСДУКЦІЯ
Викликають помірні, дефектні фаги.
Види:
загальна (генералізована)
специфічна
абортивна
Слайд 34
ТРАНСДУКЦІЯ (Ціндер і Ледерберг, 1952)
ДНК бактеріофагу
Хромосома клітини хазяїна
Клітина
А (донор)
Частинки фагу
Лізис
Фаги з частинкою ДНК хазяїна
Частинки ДНК хазяїна
Клітина
В (реципієнт)
Вмонтована в ДНК
Донорська ДНК
Слайд 36
ВІДМІННОСТІ ТРАНСДУКЦІЇ ТА ФАГОВОЇ КОНВЕРСІЇ
Трансдукція – перенос генетичної
інформації з клітини в клітину за допомогою фагу
Фагова конверсія
– експрeсія в клітині генів бактеріофагу (Corynebacterium diphtheriae, Clostridium botulinum, Staphylococcus spp., Salmonella spp.)
Слайд 37
КОН’ЮГАЦІЯ та її механізм
(Ледерберг і Тейтум, 1946)
Слайд 39
рекомбінації
Трансдукція
Кон’югація
Трансформація
Слайд 40
Молеку-
лярна
біологія
Мікро-
біологія
Біохімія
Хімічна
інженерія
Генетика
Клітинна
біологія
Молекулярна
біотехнологія
Високо-
врожайні
культури
Лікар-
ські препа-
рати
Вакцини
Діагно-
стичні
методи
Висо-
копродуктив-
ні сільськогос-
подарські
тварини
Слайд 41
ПРОДУЦЕНТИ, що найчастіше використовуються в біотехнології
ЕУКАРІОТИ –
дріжджі, плісняви, культури клітин
тварин, людини та рослин
ПРОКАРІОТИ – кишкова паличка, аеробні бацили,
псевдомонади, актиноміцети.
В ІМУНОБІОТЕХНОЛОГІЇ - використовують живі
атенуйовані або вбиті збудники інфекційних захворювань, їх окремі компоненти або продукти їх життєдіяльності (в якості вакцинних препаратів).
Для одержання ІМУННИХ СИРОВАТОК використовують лабораторних тварин, донорську або плацентарну кров людини, гібридоми
Слайд 43
Переваги одноклітинних продуцентів:
велика швидкість розмноження
використання простих, дешевих субстратів
можливість
одержання "суперпродуцентів" шляхом генетичної селекції
можливість промислового вирощування в великих
об'ємах з використанням хемостатів, ферментерів, танків.
Слайд 44
Біотехнологічні продукти мікроорганізмів - продуцентів
самі клітини як джерело
цільового продукту
крупні молекули (ферменти, токсини, антигени, антитіла, пептидоглікани та
ін.)
низькомолекулярні метаболіти, необ-хідні для росту клітин (амінокислоти, вітаміни, нуклеотіди, органічні кислоти).
антибіотики, алкалоїди, токсини, гормони
Слайд 45
СФЕРИ ВИКОРИСТАННЯ БІОТЕХНОЛОГІЇ
Слайд 46
Основні продукти, які отримують за допомогою біотехнології
Слайд 47
Деякі гормони людини, які продукуються рекомбінантними мікроорганізмами
Слайд 48
ГЕНЕТИЧНА ІНЖЕНЕРІЯ –
спрямована зміна геному продуцента в потрібному
для людини напрямку:
пересадка в геном продуцента генів з
інших організмів (людини, тварин, рослин),які кодують синтез потрібного людині продукту.
Слайд 49
"ІНСТРУМЕНТИ"
ДЛЯ ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ
ФЕРМЕНТИ (рестриктази, лігази, зворотня транскріптаза)
ВЕКТОРИ
(плазміди, помірні бактеріофаги, косміди,
транспозони, віруси)
Слайд 50
СХЕМА ГЕНЕТИЧНО - ІНЖЕНЕРНОГО ЕКСПЕРИМЕНТУ
визначення локалізації потрібного гену
(сиквенс, генетичне мапування) - клонування (виділення) потрібного гену за
допомогою рестриктакз
можливий варіант виділення іРНК і комплементарний синтез потрібного гену за допомогою зворотньої транскріптази
об'єднання ізольованого гену з геномом вектора за допомогою ферментів (рестріктаз, лігаз)
введення рекомбінантного вектору в клітину-продуцент
Слайд 51
БІОТЕХНОЛОГІЯ
Ферменти, ліки
Рекомбінантні
рослини
Білки
Ядро
Ізольований ген
Вставка у вектор
Слайд 53
ГЕНЕТИКА ВІРУСІВ
Способи збільшення інформації:
дворазове зчитування одієї іРНК з
інших ініціюючих кодонів
зсув рамки трансляції
сплайсинг (вирізання інтронів)
транскрипція з ділянок
ДНК, що перекриваються
Слайд 54
У вірусів можуть бути:
Модифікації (зміна складу білків капсиду,
суперкапсиду під впливом клітин).
Мутації (розмір бляшок під агаровим покриттям,
нейровірулентність для тварин, чутливість до дії хіміотерапевтичних агентів, ts-мутації – температурочутливі – вірус втрачає здатність розмножуватись при підвищених температурах.
Рекомбінації.
Слайд 55
ВИДИ ГЕНЕТИЧНИХ РЕКОМБІНАЦІЙ У ВІРУСІВ
1. Рекомбінація: Обмін генами
(міжгенна) та їх частинами (внутрішньогенна)
Схрещування близьких за властивостями вірусів
при одночасному культивуванні.
Наприклад, віруси поліомієліту ( збільшена і зменшена чутливість до гуанідіну, різна нейровірулентність), віруси грипу (різна нейровірулентність для мишей, але одна пневмотропність), гібридизація вірусів віспи кролика і вірусу вісповакцини
Слайд 56
ВИДИ ГЕНЕТИЧНИХ РЕКОМБІНАЦІЙ У ВІРУСІВ
2. Множинна реактивація: вірусна
інфекція викликається при зараженні віріонами з пошкодженим геномом, оскільки
функцію цього гену виконує вірус, у якого ген не пошкоджено. Нащадки – неушкоджені віруси
3. Пересортування генів: між вірусами, що мають сегментовані геноми (віруси грипу людини, кочок, свиней, буньявіруси, аренавіруси, реовіруси). Гібридні форми називають реасортанти.
Слайд 57
ВИДИ РЕКОМБІНАЦІЙ У ВІРУСІВ
4. Гетерозиготність: одночасній репродукції декількох
віріонів, різних за спадковими властивостями, утворюються віріони, що містять
певний геном одного із батьківських штамів і частину геному іншого вірусу (т.з. диплоїдні або поліплоїдні віруси). Таке об’єднання не спадкується, але дозволяє дати нащадків з різними властивостями.
Це віруси грипу, хвороби Ньюкасл
Слайд 58
ВИДИ РЕКОМБІНАЦІЙ У ВІРУСІВ
5. Транскапсидація: частина чужерідного генетичного
матерілау, заключеного всередині капсиду іншого вірусу, здатна переноситься в
стабільній формі в чутливі до основного вірусу клітини.
Аденовіруси людини не розмножуються в клітинах мавп. Але при одночасному культивуванні аденовірусів та вірусів SV-40 під одним капсидом утворюється вірус, що містить геноми обидвох вірусів, який здатний розмножуватись у клітинах мавп.
Слайд 59
ВИДИ РЕКОМБІНАЦІЙ У ВІРУСІВ
6. Крос-реактивація (рятування маркера): реактивація
інактивованого геному неінактивованим (подібно до множинної реактивації)