Презентация на тему Методы исследования белковых молекул

анализ и изучение структуры и свойств отдельных компонентов живого

вещества.
Методы биохимии преимущественно формировались в XX веке; наиболее распространенными являются:
хроматография, изобретенная М.С.Цветом в 1906г.,
центрифугирование (Т.Сведберг (Т.Сведберг, 1923 г., Нобелевская премия по химии 1926 г.)
электрофорез (А.Тизелиус (А.Тизелиус, 1937 г., Нобелевская премия по химии 1948 г.).

или метод молекулярных сит
Ионообменная хроматография
Аффинная хроматография и др.

может изменяться при разной концентрации соли или другого осадителя,

а также при изменение рН. Такой осадитель разрушает гидратную оболочку белка, падает растворимость белка в воде и он выпадает в осадок.
Осадителями могут быть: сульфата аммония – (NН4)2 SО4, ацетон, спирт.
Изменение растворимости при различных концентрациях соли и рН среды используются для выделения индивидуальных белков.
Чаще всего используют разные концентрации соли сульфата аммония – (NН4)2 SО4

и растворов высокомолекулярных веществ от растворённых в них низкомолекулярных

соединений при помощи полупроницаемой мембраны.
При диализе молекулы растворенного низкомолекулярного вещества проходят через мембрану, а неспособные диализировать (проходить через мембрану) высокомолекулярных соединения остаются в растворе. Материал, прошедший через мембрану, называется диализат.

с помощью ультрацентрифуги.
Метод заключается в том, что белки в

пробирке помещают в ультрацентрифуги. При враще­нии ультрацентрифуги скорость оседания белков пропорцио­нальна их молекулярной массе: более тяжелые бел­ки образуют фракции, расположенные ближе ко дну кюветы, более легкие — к поверхности.

мешочек из коллодия (полупроницаемого материала), в котором находится диализируемая

жидкость. Мешочек погружают в растворитель (например в воду). Постепенно концентрации диализирующего вещества в диализируемой жидкости и в растворителе становятся равными. Меняя растворитель, можно добиться практически полной очистки от нежелательных примесей.

в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду

и молекулярной массе.
Метод позволяет разделять макромолекулы, различающиеся по таким важнейшим параметрам, как размеры (или молекулярная масса), форма и электрический заряд.
Причем эти параметры могут выступать как порознь, так и в совокупности.

соответствии со своим суммарным зарядом и массой мигрируют в

направлении катода или анода.
Электрофорез проводят на носителях: бумаге, геле и т.д. Электрофорез на бумаге – скорость миграции белка зависит от заряда;
Электрофорез в геле - скорость миграции зависит от молекулярной массы.
Для обнаружения белковых фракций бумагу или гель обрабатывают красителем.
Окрашенный комплекс белков выявляет расположение различных фракций на носителе.

чтобы скорость миграции зависела только от молекулярной массы.
Для

этого анализируемую смесь обрабатывают додецилсульфатом натрия (ДСН), который представляет собой детергент с сильно выраженными амфифильными свойствами.
Развернутые полипептидные цепи связывают ДСН и приобретают отрицательный заряд.
Электрофорез проводят в тонком слое геля.
После завершения электрофореза, зоны белков выявляют c помощью красителя.
Фотография полиакриламидного геля,
иллюстрирующая разделение белков
по молекулярной массе.
Маркеры на левой дорожке.

основанный на различиях в скоростях их перемещения в системе

несмешивающихся и движущихся относительно друг друга фаз.
В основу хроматографических методов положены разные принципы: гель- фильтрации, ионного обмена, адсорбции, биологического сродства.

Класcификация видов хроматографии по механизму взаимодействия:
Распределительная хроматография
Ионообменная хроматография
Адсорбционная хроматография
Аффинная хроматография
Гель – фильтрация и др.

Хроматография (от греч. χρῶμα — цвет)

распределительной хроматографии осуществляется на колонках, в которых в качестве

неподвижной фазы применяют влажный крахмалОдин из типов распределительной хроматографии осуществляется на колонках, в которых в качестве неподвижной фазы применяют влажный крахмал или силикагель.
Образец растворяют в подходящем растворителеОбразец растворяют в подходящем растворителе, затем наносят на колонку. Разделяемые веществаОбразец растворяют в подходящем растворителе, затем наносят на колонку. Разделяемые вещества, подвергающиеся многократному распределению между неподвижной стационарной фазой (водный слой) и движущейся фазой органического растворителя, с разной скоростью перемещаются ко дну колонки.
При помощи коллектора фракций можно собрать пробыПри помощи коллектора фракций можно собрать пробы. Одна проба содержит одно вещество, которое можно выделить в чистом виде.

является хроматография на бумаге. Она оказалась наиболее доступной для

разделения аминокислот, отличающихся гидрофобностью радикалов.
В качестве неподвижной фазы служит вода, а подвижной - смесь органических растворителей (например, бутанол–уксусная кислота–вода в определенных соотношениях).
Образец помещают на одном конце бумажной полосы, этим же концом бумагу погружают в смесь, при движении растворителя по бумаге происходит разделение компонентов смеси.
Хроматограмму проявляют и высушивают, а местоположение каждого из разделяемых веществ определяют химическими или физико-химическими методами.

– нисходящая хроматография
(вид сбоку);
В – хроматограмма с разделенными

и окрашенными веществами:
1 – фронт растворителя,
2 – разделенные вещества,
3 – место нанесения образца.

и полярные молекулы, на основании зарядов разделяемых молекул.
Данный

вид хроматографии позволяет разделить практически любые заряженные молекулы, в том числе: крупные — белки, малые—молекулы нуклеотидов и аминокислот.
Неподвижная фаза имеет заряженные функциональные группы, которые взаимодействуют с анализируемыми ионизированными молекулами противоположного заряда. Этот вариант хроматографии классифицируется на два типа — катионную и анионную ионообменную хроматографию.

подходящую ионообменную смолу,
с функциональными группами

которой обменивается и задерживается на колонке часть соединений , в то время как другие беспрепятственно элюируются с колонки.
«Осажденные» на колонке вещества снимают с колонки, применяя более концентрированные солевые растворы или изменяя рН элюента.

ионообменной хроматографии в качестве неподвижной фазы используются гранулы полимера,

несущие сульфогруппы ( SО3-). Эти группы ионизированы во всем диапазоне рН и несут отрицательный заряд.
Для подготовки к работе ионообменник помещают в колонку и промывают Na+ -содержащим буферным раствором с рН 2. При этом сульфогруппа (красный цвет) связывает ионы натрия.
Если теперь нанести на колонку раствор аминокислот (1а), то положительно заряженные аминокислоты (зеленый цвет) вытеснят ионы натрия и будут сорбированны на ионите.
Поскольку аминокислоты не несут заряда в изоэлектрической точке, их элюируют с колонки буфером с более высоким значением рН (1б).
В качестве примера приведен эксперимент (3) по разделению аспарагиновой кислоты, треонина и гистидина. Графики титрования (2) наглядно объясняют, почему три аминокислоты элюирутся в указанной последовательности. Строго говоря, аминокислоты элюируются при величинах рН, значительно ниже изоэлектрических точек, поскольку за связывание с ионообменником конкурируют Na+-ионы буферного раствора.

которая содержит прочно связанные с ней отрицательно заряженные группы

(например, остатки сульфоновой кислоты -SO3-), к которым присоединены ионы Na+ .
В катионообменник вносят смесь аминокислот в кислой среде (рН 3,0), где аминокислоты в основном представляют катионы, т.е. несут положительный заряд. Положительно заряженные аминокислоты присоединяются к отрицательно заряженным частицам смолы. Чем больше суммарный заряд аминокислоты, тем прочнее её связь со смолой. Так, аминокислоты лизин, аргинин и гистидин наиболее прочно связываются с катионообменником, а аспарагиновая и глутаминовая кислоты - наиболее слабо.
Высвобождение аминокислот из колонки осуществляют вымыванием (элюированием) их буферным раствором с увеличением концентрации NaCl и рН. При увеличении рН аминокислоты теряют протон, в результате уменьшается их положительный заряд, а следовательно и прочность связи с отрицательно заряженными частицами смолы.
Каждая аминокислота выходит из колонки при определённом значении рН и ионной силы. Собирая с нижнего конца колонки раствор (элюат) в виде небольших порций, можно получить фракции, содержащие отдельные аминокислоты.

их различной сорбируемости на твердом адсорбенте.
В качестве адсорбентовВ

качестве адсорбентов используют активированный древесный угольВ качестве адсорбентов используют активированный древесный уголь, гельВ качестве адсорбентов используют активированный древесный уголь, гель фосфата кальцияВ качестве адсорбентов используют активированный древесный уголь, гель фосфата кальция, оксиды алюминияВ качестве адсорбентов используют активированный древесный уголь, гель фосфата кальция, оксиды алюминия или кремния.
АдсорбентАдсорбент в виде суспензииАдсорбент в виде суспензии с растворителемАдсорбент в виде суспензии с растворителем (чаще всего буферным раствором) вносят в колонку и равномерно в ней упаковывают.
Образец в небольшом объеме растворителяОбразец в небольшом объеме растворителя наносят на колонку – компоненты разделяемой смеси адсорбируются на адсорбенте.
Затем приступают к стадии освобождения – десорбции компонентов из колонки, применяя подходящие элюенты.
Сбор фракций осуществляют при помощи автоматического коллектора фракций.

на взаимодействии белков с лигандами, прикрепленными (иммобилизированными) к твердому

носителю.
В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент. Через колонку, заполненную лигандом, пропускают смесь белков.
К лиганду присоединяется только белок специфично взаимодействующий с ним, все остальные белки выходят с элюатом.
Белок, адсорбированный на колонке, можно смыть раствором с измененным рН или ионной силы.

ходе которой молекулы веществ разделяются по размеру за счёт

их разной способности проникать в поры неподвижной фазы.
При этом первыми выходят из колонки наиболее крупные молекулы (бо́льшей молекулярной массы), способные проникать в минимальное число пор стационарной фазы. Последними выходят вещества с малыми размерами молекул, свободно проникающие в поры. В отличие от адсорбционной хроматографии, при гель-фильтрации стационарная фаза остается химически инертной и с разделяемыми веществами не взаимодействует.

поры определенной величины. В колонку вносят смесь белков. Белки,

размер которых меньше, чем размер пор сефадекса, задерживаются в колонке, так как «застревают» в порах, а остальные свободно выходят из колонки. Размер белка зависит от его молекулярной массы.

молекулярной массе или по заряду разными методами.
Альбумин и

продукты его гидролиза можно разделить по молекулярной массе и суммарному заряду (гель – фильтрацией, электрофорезом и ионообменной хроматографией).