полимеразной цепной реакции (ПЦР)
Американский биохимик 1944 г.р.
Патент - 1985
г., фирма Cetus Corp. California Нобелевская премия по химии – 1993 г.
- Главная
- Разное
- Бизнес и предпринимательство
- Образование
- Развлечения
- Государство
- Спорт
- Графика
- Культурология
- Еда и кулинария
- Лингвистика
- Религиоведение
- Черчение
- Физкультура
- ИЗО
- Психология
- Социология
- Английский язык
- Астрономия
- Алгебра
- Биология
- География
- Геометрия
- Детские презентации
- Информатика
- История
- Литература
- Маркетинг
- Математика
- Медицина
- Менеджмент
- Музыка
- МХК
- Немецкий язык
- ОБЖ
- Обществознание
- Окружающий мир
- Педагогика
- Русский язык
- Технология
- Физика
- Философия
- Химия
- Шаблоны, картинки для презентаций
- Экология
- Экономика
- Юриспруденция
Что такое findslide.org?
FindSlide.org - это сайт презентаций, докладов, шаблонов в формате PowerPoint.
Обратная связь
Email: Нажмите что бы посмотреть
Презентация на тему Полимеразная цепная реакция как инструмент современной биотехнологии
Содержание
- 2. Кари Б. Муллис (Kary B. Mullis) –
- 7. Полимеразная цепная реакция: 1-й цикл
- 8. Полимеразная цепная реакция: 2-й цикл
- 9. Изменение температуры в типичном трехступенчатом цикле ПЦР
- 10. Полный температурный профиль полимеразной цепной реакции (25
- 11. ПЦР как молекулярная копировальная машина («молекулярный ксерокс»)После
- 12. Типичный результат амплификации ДНК с помощью ПЦРГен
- 13. Современный амплификаторТермостатируемая крышкаВозможность использования 96-луночных плашекГрадиент температуры
- 14. Компоненты, необходимые для проведения ПЦРОбъем пробы –
- 15. Структура и свойства Taq-ДНК-полимеразыНаличие 5’→3’ экзонуклеазной активностиОтсутствие
- 16. Критические характеристики ПЦР, наиболее важные для исследователяСпецифичностьТочность синтеза ДНКЭффективность
- 17. Критические характеристики ПЦР: специфичностьВ неоптимальных условиях при
- 18. ПЦР с «горячим стартом»Обратимая инактивация Taq-ДНК-полимеразы резко
- 19. Влияние концентрации праймеров на специфичность ПЦРВверху указана концентрация праймеров
- 20. Влияние температуры отжига праймеров на специфичность ПЦРАмплификация части гена фактора V системы свертывания крови человекаТемпература ,°С
- 21. Точность синтеза ДНК некоторыми термостабильными ДНК-полимеразами
- 22. Методы ПЦР
- 23. Амплификация с преимущественным использованием одного праймераОдин из
- 24. Множественная ПЦР (Multiplex PCR) – одновременная амплификация нескольких ампликонов в одной пробирке
- 25. «Гнездовая» ПЦР (Nested PCR)
- 26. Амплификация больших участков ДНК с высокой точностью
- 27. Иммуно-ПЦР (IPCR)ДНК-матрица конъюгирована с молекулами иммуноглобулинов, специфичных
- 28. Случайная амплификация полиморфных последовательностей (метод RAPD)ATCTGGAGCSalmonella
- 29. ПЦР in situ: амплификация участков ДНК или
- 30. Недостатки ПЦР, проводимой в обычном форматеНеобходимость анализа
- 31. Обычная ПЦР не позволяет определять количество матричной
- 32. Количественная ПЦР ПЦР в реальном времени Real-time
- 33. Устройство капиллярного амплификатора LightCyclerКапилляры объемом 20
- 34. Российские производители амплификаторов для проведения ПЦР в
- 35. Принцип действия зондов TaqMan5’→3’-экзонуклеаза Taq-ДНК-полимеразы отщепляет флуоресцентный краситель, который начинает флуоресцировать в реакционной смеси ФлуорофорГаситель флуоресценции
- 36. Принцип действия зондов, основанных на резонансном переносе энергии флуоресценции (FRET - fluorescence resonance energy transfer)
- 37. Принцип действия зондов – молекулярных маяков (molecular
- 38. Праймеры, меченые флуорофорами, в ПЦР в реальном времениПраймеры «Амплифлюр»Праймеры «Скорпион»
- 39. Мониторинг накопления продуктов ПЦР в реальном времени протекания реакцииСTСT – пороговый цикл
- 40. Калибровочная кривая для определения количества ДНК-матрицы в
- 41. Цифровая ПЦР (Digital PCR) (на основе эмульсионной ПЦР)
- 42. Эмульсионная (эм)ПЦР на мирочастицах с иммобилизованным праймеромНачало
- 43. Амплификация ДНК на твердой (стеклянной) подложкеВторая стратегия
- 44. Стратегии получения полимеразных колоний в секвенаторах второго
- 45. ПЦР в прикладных исследованияхДНК-диагностика
- 46. Что такое «ДНК-диагностика»?Постановка диагноза заболевания или выявление
- 47. Геном человека в связи его болезнямиКоличество известных
- 48. ДНК-полиморфизмы – основа генетической индивидуальности человекаПолиморфизмы –
- 49. Поиск SNP в генах человекаПоиск SNP в
- 50. Аллель-специфическая ПЦРПринцип действия аллель-специфических праймеров: Элонгация праймера
- 51. Выявление мутации FV Leiden в геноме человека
- 52. ПЦР в реальном времени: принцип действия системы TaqMan с аллель-специфическими зондами
- 53. Выявление мутации FV Leiden c помощью ПЦР в реальном времени и аллель-специфических зондов
- 54. Скачать презентацию
- 55. Похожие презентации
Кари Б. Муллис (Kary B. Mullis) – изобретатель полимеразной цепной реакции (ПЦР)Американский биохимик 1944 г.р.Патент - 1985 г., фирма Cetus Corp. California Нобелевская премия по химии – 1993 г.
Слайд 2 Кари Б. Муллис (Kary B. Mullis) – изобретатель
полимеразной цепной реакции (ПЦР)
г., фирма Cetus Corp. CaliforniaНобелевская премия по химии – 1993 г.
Слайд 10
Полный температурный профиль полимеразной цепной реакции (25 циклов)
a
– начальная
денатурация
ДНК
b
– собственнореакция
с – достройка
цепей ДНК
d – хранение 4°С
Слайд 11
ПЦР как молекулярная копировальная машина («молекулярный ксерокс»)
После 6
циклов ПЦР образуется 64 идентичных копии исходного генетического локуса
(ампликона)
Слайд 12
Типичный результат амплификации ДНК с помощью ПЦР
Ген фактора
V системы свертывания крови человека (амплимер)
Размер продукта – 174
п.о.20 циклов ПЦР
Электрофорез в 3% агарозном геле
Окраска бромистым этидием
M
Ампликоны
Слайд 13
Современный амплификатор
Термостатируемая крышка
Возможность использования 96-луночных плашек
Градиент температуры вдоль
нагревающего блока
Возможность регуляции скорости перехода от одного сегмента цикла
к другому (ramp time)«Терцик» фирмы ДНК-технология (Москва) – высококачественный отечественный амплификатор
Слайд 14
Компоненты, необходимые для проведения ПЦР
Объем пробы – 0,5-50
мкл
Анализируемая ДНК – 50-100 нмолей, 0,1-0,25 мкг (до 1
молекулы в пробе)Термостабильная ДНК-полимераза
4 Дезоксирибонуклеозидтрифосфата (4 dNTPs –dATP, dGTP, TTP, dCTP) – 0,2 мМ
Олигонуклеотидные праймеры – длина 17-25 н.т. (0,5-1,0 мкМ)
Ионы Mg2+ - 0,5-3,0 мкМ
Буферный раствор
Все компоненты ПЦР производятся в ИБХ РАН
Слайд 15
Структура и свойства Taq-ДНК-полимеразы
Наличие 5’→3’ экзонуклеазной активности
Отсутствие 3’
→5’ экзонуклеазной активности
Высокая термостабильность (время полужизни: ~
2 часа при 95С)Скорость синтеза ДНК ~ 50 нт/сек при 72С
Слайд 16
Критические характеристики ПЦР, наиболее важные для исследователя
Специфичность
Точность синтеза
ДНК
Эффективность
Слайд 17
Критические характеристики ПЦР: специфичность
В неоптимальных условиях при амплификации
образуются неспецифические продукты ПЦР (шмир, дополнительные полосы, в т.ч.
димеры праймеров)Электрофорез в агарозном геле, окраска бромистым этидием,
Слайд 18
ПЦР с «горячим стартом»
Обратимая инактивация Taq-ДНК-полимеразы резко увеличивает
специфичность ПЦР
Добавление в реакционную смесь некоторых соединений (DMSO, бетаин,
2-пирролидон) приводят к тому же эффектуАмплификация гена tPA
Обычная ПЦР ПЦР с горячим стартом»
Уменьшение содержания ДНК в пробе >>>
Слайд 20
Влияние температуры отжига праймеров на специфичность ПЦР
Амплификация части
гена фактора V системы свертывания крови человека
Температура ,°С
Слайд 23
Амплификация с преимущественным использованием одного праймера
Один из праймеров
в меньшей концентрации
В основном образуется одноцепочечный продукт ПЦР
Линейное увеличение
продукта ПЦР Асимметричная ПЦР
Слайд 24 Множественная ПЦР (Multiplex PCR) – одновременная амплификация нескольких
ампликонов в одной пробирке
Слайд 26 Амплификация больших участков ДНК с высокой точностью (Long
PCR, LA PCR)
Амплификация участков ДНК до 200 т.п.н. (целых
эукариотических генов и вирусных геномов)Использование смесей из двух ДНК-полимераз, одна из которых обладает 3’→5’-экзонуклеазной активностью
Использование высокоочищенных dNTPs
Слайд 27
Иммуно-ПЦР (IPCR)
ДНК-матрица конъюгирована с молекулами иммуноглобулинов, специфичных в
отношении анализируемого антигена
Конкурентная иммуно-ПЦР: конъюгат лиганда с ДНК-матрицей конкурирует
со свободным лигандом за АТ1000-Кратное увеличение чувствительности стандартного иммуноферментного метода
Слайд 29 ПЦР in situ: амплификация участков ДНК или РНК
в интактных клетках
Фиксация 10% формалином клеток и тканей, помещение
в парафиновые блоки, пермеабилизация клеточных мембран протеиназами (пепсин), их удаление диэтилпирокарбонатом, амплификация с биотинилированными нуклеотидами, детекцияПозволяет:
Локализовать анализируемые последовательности во внутриклеточном пространстве
Обнаруживать 1 копию последовательности на фоне 1 μg ДНК, т.е. уникальные гены и их транскрипты
Находит широкое применение в вирусологии, онкологии и биологии развития
Слайд 30
Недостатки ПЦР, проводимой в обычном формате
Необходимость анализа продуктов
ПЦР после завершения реакции
Электрофорез
Гибридизация и т.п.
Опасность кроссконтаминаций продуктами ПЦР
Невозможность
количественной оценки содержания амплифицируемой матрицы в анализируемых образцахСлайд 31 Обычная ПЦР не позволяет определять количество матричной ДНК
или РНК в пробе
Ни одна из стадий ПЦР не
завершается с эффективностью 100%Накопление ингибиторов ПЦР при прохождении реакции
Наименее эффективны завершающие циклы
Решение проблемы с помощью ПЦР в реальном времени
Слайд 32 Количественная ПЦР ПЦР в реальном времени Real-time PCR Позволяет, не открывая
пробирки, непрерывно следить за накоплением продуктов ПЦР в пробах
Слайд 33
Устройство капиллярного амплификатора
LightCycler
Капилляры объемом 20 мкл обеспечивают
высокое соотношение поверхности к объему и высокую скорость теплообмена.
30 циклов завершаются за 20-30 минСлайд 34 Российские производители амплификаторов для проведения ПЦР в реальном
времени
Институт аналитического приборостроения РАН, С-Петербург совместно с фирмой
«Синтол», МоскваФирма «ДНК-Технология», Москва
Флуоресцентно-меченые зонды – «ДНК-синтез», (ИБХ РАН), фирма «Синтол», Москва
Слайд 35
Принцип действия зондов TaqMan
5’→3’-экзонуклеаза Taq-ДНК-полимеразы отщепляет флуоресцентный краситель,
который начинает флуоресцировать в реакционной смеси
Флуорофор
Гаситель флуоресценции
Слайд 36 Принцип действия зондов, основанных на резонансном переносе энергии
флуоресценции (FRET - fluorescence resonance energy transfer)
Слайд 37 Принцип действия зондов – молекулярных маяков (molecular beacon
probes)
В растворе зонды образуют структуру «стебель-петля», что приводит к
сближению флуорофора и гасителя флуоресценции
Слайд 38
Праймеры, меченые флуорофорами, в ПЦР в реальном времени
Праймеры
«Амплифлюр»
Праймеры «Скорпион»
Слайд 39 Мониторинг накопления продуктов ПЦР в реальном времени протекания
реакции
СT
СT – пороговый цикл
Слайд 40
Калибровочная кривая для определения количества ДНК-матрицы в пробе
Определение
числа плазмидных копий гена F8 в трансфицированных клетках человека
Концентрация
ДНК в крайних точках различается на 9 порядков
Слайд 42
Эмульсионная (эм)ПЦР на мирочастицах с иммобилизованным праймером
Начало 1-го
цикла эмПЦР
Начало 2-го цикла эмПЦР
Начало 3-го цикла эмПЦР
эмПЦР
Матрица оцДНК
Праймеры
Гидрофобная
фазаэмПЦР
Слайд 43
Амплификация ДНК на твердой (стеклянной) подложке
Вторая стратегия получения
полимеразных колоний в секвенаторах второго поколения
1
2
3
4
Иммобилизация праймеров и матрицы
на стекле ПЦРМолекулярные кластеры молекул ДНК
Секвенирование
Слайд 44
Стратегии получения полимеразных колоний в секвенаторах второго поколения
Одна
молекула ДНК/кластер
Подготовка ДНК, 5 мкг
ПЦР
на стекле
100-200 млн молекулярных
кластеровРост кластеров
Арочная амплификация
Слайд 46
Что такое «ДНК-диагностика»?
Постановка диагноза заболевания или выявление предрасположенности
к нему путем определения особенностей структуры генов (ДНК) обследуемого
пациента
Слайд 47
Геном человека
в связи его болезнями
Количество известных генов, ассоциированных
с болезнями – >1500 (OMIM – Online Mendelian Inheritance
in Man)Количество заболеваний, диагностируемых на генетическом уровне – >1000
Количество генетических тест-систем, используемых в современной клинике – >650
Слайд 48
ДНК-полиморфизмы – основа генетической индивидуальности человека
Полиморфизмы – это
мутации с частотой >1%
SNP – (single nucleotide polymorphisms) полиморфизмы
по отдельным нуклеотидам – обнаружено в геноме человека – >10,000,000Геномы двух людей различаются по ~1,500, 000 SNP, (1 SNP/180 п. н., исследовано 137 человек)
CNV – copy number variation (различия в числе копий участков генома)
Слайд 49
Поиск SNP в генах человека
Поиск SNP в генах
пациентов, ассоциированных с заболеваниями – одно из главных направлений
современных медико-генетических исследований
Слайд 50
Аллель-специфическая ПЦР
Принцип действия аллель-специфических праймеров:
Элонгация праймера происходит
только в том случае, если его 3’-концевой нуклеотид комплементарен
матричной ДНКСлайд 51 Выявление мутации FV Leiden в геноме человека с использованием
