Слайд 2
Микрочипы
2. Белки (пептиды)
3. Органические молекулы
1. ДНК
Слайд 3
Технология чипов
Massively Parallel Signature Sequencing (MPSS)
Polony sequencing
454 pyrosequencing
Illumina
(Solexa) sequencing
SOLiD sequencing
Ion semiconductor sequencing
DNA nanoball sequencing
Helicos single molecule
sequencing
Single molecule real time (SMRT) sequencing
Nanopore DNA sequencing
Sequencing by hybridization
Sequencing with mass spectrometry
Microfluidic Sanger s
equencing
Microscopy-based techniques
RNAP sequencing
In vitro virus high-throughput sequencing
Слайд 4
Illumina (Solexa) sequencing
Transposase is an enzyme is an enzyme that binds to the
end of a transposon is an enzyme that binds to the end of
a transposon and catalyzes the movement of the transposon to another part of the genome by a cut and paste mechanism or a replicative transposition mechanism.
Слайд 5
Helicos single molecule sequencing
Слайд 6
DNA microarray (also commonly known as DNA (also commonly known as DNA chip or biochip)
is a collection of microscopic DNA spots attached to
a solid surface.
Слайд 7
http://en.wikipedia.org/wiki/DNA_microarray
Слайд 9
Each DNA spot contains picomoles (10−12 moles) of
a specific DNA sequence, known as probes (or reporters
or oligos). These can be a short section of a gene or other DNA element that are used to hybridize a cDNA or cRNA (also called anti-sense RNA) sample (called target) under high-stringency conditions. Probe-target hybridization is usually detected and quantified by detection of fluorophore-, silver-, or chemiluminescence-labeled targets to determine relative abundance of nucleic acid sequences in the target.
Слайд 10
Microarray technology evolved from Southern blotting
Слайд 11
In standard microarrays, the probes are synthesized and
then attached via surface engineering to a solid surface
by a covalent bond to a chemical matrix (via epoxy-silane, amino-silane, lysine, polyacrylamide or others). The solid surface can be glass or a silicon chip, in which case they are colloquially known as an Affy chip when an Affymetrix chip is used. Other microarray platforms, such as Illumina, use microscopic beads, instead of the large solid support. Alternatively, microarrays can be constructed by the direct synthesis of oligonucleotide probes on solid surfaces. DNA arrays are different from other types of microarray only in that they either measure DNA or use DNA as part of its detection system.
The traditional solid-phase array is a collection of orderly microscopic "spots", called features, each with thousands of identical and specific probes attached to a solid surface, such as glass, plastic or silicon biochip (commonly known as a genome chip, DNA chip or gene array). Thousands of these features can be placed in known locations on a single DNA microarray.
The alternative bead array is a collection of microscopic polystyrene beads, each with a specific probe and a ratio of two or more dyes, which do not interfere with the fluorescent dyes used on the target sequence.
Слайд 12
Scientists use DNA microarrays to measure the expression
levels of large numbers of genes simultaneously (tens of
thousands of probes) or to genotype multiple regions of a genome (many genetic tests in parallel).
Слайд 13
Gene expression profiling
Comparative genomic hybridization
GeneID
Chromatin immunoprecipitation on Chip
DamID
SNP
detection
Alternative splicing detection
Fusion genes microarray
Tiling array
Слайд 14
Sets of genes that are active in a
variety of tumors.
the data, which came from 26 cancer
studies published in prominent journals and includes a total of 14,000 genes and 22 types of tumors.
Слайд 15
Using a new online cancer database, scientists have
sifted through genetic information about some 3,000 tumors and
identified a group of genes that are altered in most if not all cancers.
The 67 genes are either more or less active in cancer cells than they are in healthy cells. For scientists, the genes are a resource for developing diagnostic tests and therapies that target these genes.
In addition, the researchers identified 69 genes that are altered in aggressive cancers, including some genes from the original group.
Sets of genes that are active in a variety of tumors.
Слайд 16
Identifying potential cancer driver genes by genomic data
integration. Yong Chen, Jingjing Hao, Wei Jiang, Tong He,
Xuegong Zhang, Tao Jiang & Rui Jiang. 2013. Nature. 3:3538.
Total 717 regulatory connections existed among 163 known cancer genes and 164 predicted driver genes were extracted from the DAVID database. The graph was drawn by using Cytoscape software. Among 163 known cancer genes, 23 genes are predicted as driver genes (red).
Figure 5: Correlations among known cancer genes and predicted driver genes.
Слайд 17
ViroChip (2004)
Чип для определения вирусов. На чип нанесены
ДНК 22 000 известных вирусов
Слайд 18
Микрочипы
3. Органические молекулы
1. ДНК
2. Белки (пептиды)
Слайд 20
Белковые микрочипы
Образцы
сыворотки
Опухолевые экстракты, рекомбинантные белки
Антительные микрочипы
+
IgG
с
меткой
Слайд 21
Недостатки методов определения аутоантител
Низкая возможность автоматизации
Значительная трудоемкость
Высокая стоимость
Ограниченные/закрытые
системы (использование хорошо изученных антигенов и антител)
Слайд 22
Микрочип (микроэррей) с синтетическими пептидами
Микроэррей = автоматизция =
снижение стоимости
Высокая воспроизводимость результатов
Гибкая/открытая система (оценка не известных опухолевых
антигенов)
Иммуносигнатура
Слайд 23
Очень краткий иллюстрированный словарь микрочипового жаргона
Микрочип или чип
Микроэррей
(х24)
330
000 точек
(spots)
На каждой точке определенный синтетический пептид со
“случайной” аминокислотной последовательностью
Эррей (array) – упорядоченное расположение объектов, обычно в ряды и колонки
Слайд 24
Антитела из сыворотки
связывающееся с пептидами
Вторичные антитела с
флуоресцентной меткой
распознающие человеческий IgG
Чип
24 микроэррей
330 000 точек
(spots)
Слайд 25
Разведение (1:20 000)
Обработка
микрочипов
Образцы крови
Сыворотка
Сканирование
Лабораторный протокол
Разработка диагностического метода
по капле крови
Слайд 26
Камера для работы с микрочипами
96-луночный (4x24) формат
Слайд 28
Нормализация и контроль качества
Сканирование
Иммуносигнатура
Выбор пептидов
Визуализация результатов
иммуносигнатуры
Анализ
имиджей
Оцифрованние результатов
Биоинформатика
анализ иммуносигнатур
Слайд 29
Первый тест РАПРЦ
Рак молочной железы
Здоровый донор
Слайд 30
140 пептидов способны показать различая между сыворотками полученными
от разных доноров.
Рак молочной железы
Здоровый донор
Рак МЖ
Здоровый
донор
Слайд 31
Астроцитома (166)
Рак МЖ IV (42)
Глиобластома (27)
Саркома (20)
Олиго/Астро (97)
Олигодендроглиома
(48)
Рак МЖ II, III (141)
Доноры без
признаков ОЗ (249)
Панкреатит (82)
Миелома
(112)
Рак матки (86)
Рак легкого (107)
Рак поджелудочной
железы (136)
Долинная лихорадка (142)
Рак МЖ
Вторичный (61)
Иммуносигнатуры различных заболеваний
Stafford P. Immunosignature system for diagnosis of cancer. PNAS 2014;111(30):E3072-80
Слайд 32
Использование Immunosignature
Ранняя диагностика заболеваний
Злокачественные новообразования
Инфекционные
Аутоиммунные
Аллергия (anti-IgE)
Эффективность терапии/вакцин
Прогноз отторжения
трансплантата
Определение опухолевых антигенов
Определение эпитопов
Белок-белковые взаимодействия
Патологии беременности
Определение пола плода на
ранних стадиях
Диагностика резус конфликта
Допинг тестирование
Слайд 33
Чипы с пептидами с известной аминокислотной последовательностью
Слайд 34
Белок-белковые взаимодействия
Лиганд-рецептор пары
Малые молекулы
IL-2
IL-2
MMP-2
MMP-2
Альтернатива ИФА
Слайд 35
LSQETFSDNLWKLLPEN
Определение опухолевых антигенов (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)
Рак кишечника и
мелко клеточная
карцинома
Слайд 36
Фаговый дисплей и Immunosignature
Sykes KF Trends in Biotechnology
2012
Слайд 37
Использование фагового дисплея для Immunosignature
IgG от здоровых доноров
на сферах с белком G
Фаговый дисплей пептиды
Не специфически связанные
пептиды
Обогащение несвязанных колоний
Выделение фаговых колоний
Пептидные эррей
Сыворотка здоровых доноров
Сыворотка онкологических пациентов
Чипы, сферы, планшеты
Слайд 38
Иммуоносигнатура и
молекулярная сигнатура
Астроцитома (23)
Здоровые доноры (34)
Мультиформная
глиобластома
Олигодендроглиома (18)
Олиго/Астро (16)
MGMT промотор
метилирование
+ (16) -
(6)
100 наиболее информативных пептидов выявлены используя ANOVA.
Hughes KH 2012 PLOS
Слайд 39
Микрочипы
1. ДНК
2. Белки (пептиды)
3. Органические молекулы
Слайд 40
Чипы с органическими молекулами
Иммобилизованные на чип
Не иммобилизованные на
чип (сухие)
Не иммобилизованные (в растворе)
Слайд 41
Другие чипы - более “сложные” чипы
Слайд 42
КАТАЛОГ ПРОДУКЦИИ
Микрофлюидные автоматизированные системы LabChip.
Мультимодальные микропланшетные ридеры.
Микропланшетный оптический
биосенсор Epic LabelFree.
Анализаторы и реагенты для технологии ALPHA Screen.
Автоматизированные
станции пробоподготовки и роботы для молекулярно-биологических исследований.
Системы оптического имиджинга in vivo.
Системы клеточного скрининга.
Слайд 43
Микрофлюидные технологии
Системы LabChip®
LabChip EZ
Ключевым компонентом системы являются
миниатюрные чипы с вытравленными микроканалами. В микроканалах чипов в
автоматическом режиме происходит высокоскоростное препаративное или аналитическое электрофоретическое разделение биомолекул с последующей детекцией.
1
Слайд 45
Смещение подвижности: разница соотношений заряда к массе у
непрореагировавшего субстрата и продукта используется для разделения на микрофлюидном
чипе. На рисунке приведен пример изучения свойств протеинкиназы на ридере LabChip EZ. Субстрат – нефосфорилированный пептид - мигрирует в электрическом поле медленнее, чем фосфорилированный продукт. И субстрат, и продукт детектируются по флуоресценции, индуцированной светодиодом.
Слайд 46
Ридер LabChip® EZ: всесторонний анализ ферментов
Ридер LabChip EZ
от компании PerkinElmer – абсолютно необходимый прибор при работе
в области поиска веществ с заданной биологической активностью, анализе ферментов и изучении свойств биомолекул. Совмещая в себе преимущества капиллярного электрофореза с технологией забора проб через иглу («сиппер») микрофлюидного чипа (так называемый «сиппер-чип»), данная система выполняет анализ смещения электрофоретической подвижности. Этот метод особенно хорошо зарекомендовал себя в
фармакологических исследованиях, поскольку обеспечивает прямое высокоточное определение продукта и субстрата и получение кинетических данных в режиме реального времени с хорошей воспроизводимостью.
Слайд 47
Области применения:
Пробоподготовка (в том числе для NGS)
Разделение
Амплификация
Клеточный анализ
Геномика
Протеомика
Поиск
кандидатов в лекарственные препараты
Молекулярная диагностика
Иммунодиагностика
Протеомика – наука, занимающаяся изучением совокупности белков
и их взаимодействий в живых организмах (протеом – совокупность всех белков организма).
Геномика – наука, занимающаяся изучением структуры и функций генов (геном – совокупность всех генов организма).
Слайд 48
Киназы
Протеазы
Фосфатазы
Липидкиназы
Фосфодиэстеразы
Белки, связывающиеся с ДНК/РНК
Ферменты эпигенетических модификаций
(гистонацетилтрансферазы, деацетилазы
гистонов, метилтрансферазы,
Система LabChip EZ рекомендована при работе со следующими
объектами:
Слайд 49
LabChip®DS: сверхбыстрое сканирование спектра в микрообъеме
2
Слайд 50
Безметочная технология детекции
Corning®Epic®
Специализированный модуль Label-free на базе
платформы EnSpire обеспечивает детекцию фенотипических изменений клеток, а также
равновесный анализ межмолекулярных взаимодействий без использования каких-либо меток. Измерение происходит в специальных планшетах, соответствующих стандартам ANSI/SBS. В дно каждой лунки планшета интегрирован биосенсор. Модуль LabelFree оснащен источником света и детектором, улавливающим изменения в коэффициенте преломления среды в непосредственной близости от поверхности сенсора (до 150 нм) в режиме реального времени. Детекция основана на феномене волноводного резонанса на дифракционной решетке.
3
Аналог Biocore (4 дорожки)
или ProteOn (6 дорожек)
Слайд 53
Типичные приложения:
Клеточная адгезия
Хемотаксис
Цитотоксичность
GPCRs (рецепторы, сопряжённые с G-белком,
также известные как семиспиральные рецепторы или серпентины, составляют большое
семейство трансмембранных рецепторов. )
Гетродимеризация GPCRs
Ионные каналы
Рецепторы ядерных гормонов
Фагоцитоз
Рецепторные тирозинкиназы
TLRs (Толл-подобные рецепторы — класс клеточных рецепторов с одним трансмембранным фрагментом, которые распознают консервативные структуры микроорганизмов и активируют клеточный иммунный ответ.
Транзиентная трансфекция
Инфицирование вирусами
Слайд 54
Технология Альфа, запатентованная компанией PerkinElmer, основана на использовании
микрочастиц, на которых закрепляются биомолекулы, специфичные к различным лигандам.
4
Слайд 55
Список доступных наборов для работы с технологией Альфа
Формат AlphaScreen
Ангиогенез
Аутофагия
Биопроцессы
Канцерогенез
Сердечно-сосудистая система
Центральная нервная система
Воспаление
Метаболизм
Вирусология
Анализ ацетилирования
Анализ метилирования
Другие посттрансляционные
модификации
Наборы AlphaScreen SureFire для анализа внутриклеточной передачи сигнала
AlphaScreen для детекции цАМФ
AlphaScreen для детекции цГМФ
AlphaScreen для детекции гибридных белков: c-MYC, GST, гистидина
AlphaScreen для детекции с помощью IgG
AlphaScreen для детекции фосфотирозина
