Презентация на тему Биофармацевтика, занятие 8Белки системы гемостаза и терапевтические ферменты

и FIXa (right) are attached to cell membrane. Catalytic

residues of FIXa are shown in yellow. Area of direct contact between FVIIIa and FIXa are loop 558 in A2 domain of FVIIIa (red) and alpha helix 330 in FIXa (blue).

Fay. Blood Rev. 18:1-15, 2004.

заболевания, вызывыаемые дефектами генов факторов VIII и IX.
Частота встречаемости

около 1 случая на 5000 мужчин для A и 1 на 30 000 мужчин для B.
Требуют постоянной заместительной терапии факторами свертывания крови.

Длина 186 т.п.о., 26 экзонов (приблизительно соответствуют доменам белка

фVIII).
Длина мРНК - 9 т.п.о. (кодирующая область 7053 п.о.)
Длинные интроны (14-32 кб)
Наиболее частая мутация при гемофилии – в самом длинном из интронов (№22, 32кБ)

заражение пациентов вирусом гепатита С и ВИЧ
Неконтролируемые кровотечения требуют

сложного хирургического вмешательства
Появление ингибитора ФVIII (антител) является частым событием, до 40% случаев

альбумин, БСА – бычий сывороточный альбумин,
ДР – обработка

детергентом и растворителем, НФ – нанофильтрация.

секреция продукта клетками
Нестабильность продукта в культуральной среде
Большой размер полипептида

– требует использования крупнопористых сорбентов
Повышенные требования к отсутствию посторонних примесей и инактивации вирусов

J. Biochem. 232, 19-27 (1995)

Eur. J. Biochem. 232, 19-27 (1995)

al Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2008, Vol. 6, 470-7

Бенефикс), одобренн для применения в США и странах ЕС

в 1997 г.
Получают в клетках CHO, культивируемых в питательной среде, не содержащей сыворотки или других продуктов животного происхождения.
Выделение и очистку рекомбинантного FIX проводят при помощи четырех хроматографических стадий, не используя иммуноаффинную хроматографию.
Потенциально присутствующие вирусы удаляют при помощи нанофильтрации на фильтре с порогом отсечения 70 кДа.
В готовой лекарственной форме нонакога альфа не используется альбумин человека.
Флаконы по 250–2000 МЕ лиофилизованного белка (~1-8 мг), хранение при комнатной температуре.

хроматографии
Пастеризация в растворе
Тепловая обработка лиофилизата
Нанофильтрация при помощи мембран
Стандартная цель

при разработке процессов вирус-инактивации – понижение титра модельных вирусов на 7-14 порядков.

НовоСэвен РТ.
Показания – кровотечения при ингибиторной форме гемофилии, приобретенная

гемофилия
Флакон с лиофилизатом 1-8 мг и шприц с растворителем. Типичная дозировка – 90 мкг/кг в/в болюсно каждые 2 ч до прекращения кровотечения
Способ получения – секреция клетками BHK в культуральную среду с сывороткой, иммуноаффинная хроматография, активация при очистке, вирус-инактивация детергентом и нанофильтрацией
Только 3% выпускаемого препарата используются по назначению, остальные 97% - для остановки кровотечений различной этиологии.

культуральной жидкости
Рабочий банк клеток-продуцентов фVII
Технология получения фактора VIIa (upstream)

VIIa (downstream)
Культуральная жидкость
Отделение клеток и дебриса центрифугировнием
Аффинная хроматография
Ультрафильтрация
10 кДа
Хранение

замороженного концентрата

Анионообменная хроматография

Внесение стабилизаторов и лиофилизация

Анионообменная хроматография
(активация)

of Medicine reviewed reports of adverse events with NovoSeven

in FDA’s Adverse Event Reporting System database from March 25, 1999 to Dec. 31, 2004. Among 431 adverse events, 168 described 185 thromboembolic events. About 151 reports were due to use of NovoSeven for off-label indications: in patients without hemophilia.
…Novo Nordisk withdrew a pending supplemental application in the European Union (EU) for treatment of acute intracerebral hemorrhage (ICH) in adults after EU authorities had requested additional safety and efficacy data. … the primary endpoint was not attained in the pivotal Phase III ICH trial...
NovoSeven is being used by the U.S. military to treat critically wounded U.S. troops in Iraq, despite this being an off-label indication... However, the Army medical command considers NovoSeven a medical breakthrough that gives front-line physicians a way to control deadly bleeding. Physicians in Iraq have used it in more than 1,000 patients (11/2006). Military doctors report patients requiring transfusions of 10 or more units of blood have a 25%-50% chance of dying from their injuries, and that there is enough evidence of NovoSeven’s effectiveness to continue its use. As noted by one physician, “Patients who are hemorrhaging to death, they get the drug and it stops. Factor VII saves their lives.” However, military physician in Germany and U.S. have reported unusual and sometimes fatal blood clots in soldiers evacuated from Iraq, including unexplained strokes, heart attacks and pulmonary embolisms, or blood clots in the lungs; and some suspect NovoSeven is the cause. Determining the precise cause of blood clots is rarely possible, making it difficult to establish definitively whether NovoSeven is responsible for these adverse events. The U.S. military continues to use NovoSeven in Iraq (and presumably other areas of active combat).

разрешен к применению только в США
Получают в клетках CHO

как протромбин с удаленным Gla-доменом и заменой лидерного пептида.
Продукт частично активируется до тромбина при секреции, полностью – в процессе очистки путем автокатализа.
Лекарственная форма – лиофилизат по 5000 МЕ и 20000 МЕ (~1,7 мг и ~6,7 мг).
Применение – местное, в области разрезов при хирургии, раствор или смесь с желатиновой губкой.
Самый неудачный рекомбинантный белок в фармацевтике – доля рынка 13% от всех препаратов тромбина, цена за МЕ в 2 раза выше, чем для тромбина быка, но всего лишь $68 за флакон (а за 1,2 мг НовоСэвен - $1800)

замена Ile на Leu на N-конце, не сульфатирован.
Лиофилизат по

50 мг с маннитолом, T1/2=80 мин
Показания – гепарин-индуцированная тромбоцитопения (0.76% пациентов, получавших нефракционированный гепарин)

пути и встречается у 0,2–0,4% населения.
Большинство носителей этой

патологии гетерозиготны, и уровень АТ III колеблется у них в пределах от 40 до 70%. Гомозиготный дефицит АТ III не совместим с жизнью.
Известны два типа гетерозиготного дефицита этого фактора. При первом типе снижено его количество в циркуляции, а при втором нарушена функция, но его количество нормально. У больных с венозными тромбозами частота дефицита АТ III составляет 5%.
Стандартная терапия – антикоагулянты, АТ-III при хирургических вмешательствах и родах

коз
Лиофилизат по 1750 МЕ (250 мг), вспомогательные вещества –

глицин, NaCl, цитрат натрия.
Дозировки – около 1 флакона для повышения уровня AT-III до нормального и ~1 флакон за 5 часов для поддержания уровня.
T1/2 рекомбинантного AT-III понижено в 8-10 раз из-за уменьшения уровня процессинга N-связанных олигосахаридов

и регуляторных последовательностей гена бета-казеина козы
Первичные трансгенные животные F0

получены микроинъекцией плазмиды в ядра клеток ранних эмбрионов и их имплантацию суррогатным матерям
Животные-продуценты F1 и F2 получены скрещиванием высокопродуктивных F0

замороженной спермы и отобранные козы F0 и F1
Рабочий банк

– отобранные козлы и козы из потомства F0 и F1, образцы замороженной спермы отобранных козлов.
Размер стада продуцентов – 1500 голов, порода группы “Swiss breed”
Типичная продуктивность одной козы – 3 кг AT-III в год
Выход продукта – 55%, процесс очистки включает микрофильтрацию, хроматографию на иммобилизованном гепарине, анионообменную, гидрофобную, ультрафильтрацию и формулирование.
Вирус-инактивация нанофильтрацией и пастеризацией.

причинам смерти во всех странах.
Около половины смертельных исходов

при ИМ происходят уже после помещения больного в стационар и по большей части могут быть предотвращены своевременным лечением.
Одним из существенных факторов смертности и инвалидизации больных является невозможность быстро устранить тромб в коронарной артерии и восстановить кровоснабжение пораженного участка сердечной мышцы.

связывание с фибрином;
Фибронектиновый палец (fibronectin finger) - связывание

с фибрином с высокой аффинностью;
ЭФР (EGF) печеночный клиренс (выведение через печень);
Домен сериновой протеиназы – каталитическая активность, связывание с ингибитором ТАП 1 типа;
Сайты гликозилирования - клиренс (выведение через клетки эндотелия печени)

Структурно-функциональная характеристика доменов ТАП

обладает фибрин-специфичностью, то есть активируется как связанный с фибрином

тромба, так и свободно циркулирующий ПЛГ. Это приводит к значительному системному фибринолизу, истощению в кровотоке фибриногена и альфа2-антиплазмина, что увеличивает риск неконтролируемых внутренних кровотечений.
Второе поколение тромболитиков (препараты полноразмерного ТАП, проурокиназы, анистреплазы, стафилокиназы) характеризуется высокой специфичностью по отношению к связанному с фибрином ПЛГ, но вызывает умеренный системный фибринолиз, сопровождаемый повышенным риском внутричерепных кровоизлияний. 
Препараты третьего поколения (делеционные варианты ТАП - ретеплаза, тенектеплаза, монтеплаза, ланотеплаза; химерные молекулы, содержащие активные фрагменты ТАП или УК) наряду с высокой избирательностью действия обладают различными дополнительными преимуществами и достаточно безопасны, многие из этих лекарств еще проходят клинические испытания. 

стрептокиназа и урокиназа, быстро выводится из циркуляции: время полужизни

в плазме человека СК - 18 мин, УК - 16 мин и полноразмерного ТАП - 9 мин.
Вследствие этого, полноразмерный ТАП необходимо вводить путем продолжительной инфузии.
Длительная обработка пациента системным введением активаторов стимулирует фибринолитическую систему, результатом чего являются опасные кровотечения из-за разрушения фибриногена и предрасположенность пациента к ретромбозам из-за истощения плазминогена.

11, 2381-2399, September 1, 2006

клеток человека A-293 из-за необходимости поддерживать  β-гидроксилирование Asp71
Очистка без

использования иммуноаффинной хроматографии – анионообменная хроматография с элюцией хлоридом кальция, активация тромбином
Лиофилизат по 5 мг или 20 мг, введение в/в по 12-30 мкг/кг/ч в течение 48-96 ч

of drotrecogin alfa (activated).
Rudis MI, Fish DN.
Department of Clinical Pharmacy,

School of Pharmacy, University of Southern California, Los Angeles, California 90033, USA. rudis@hsc.usc.edu

Abstract
The protein C pathway, which plays an important role in maintaining normal hemostasis and is a critical link between the inflammatory and procoagulant host responses to infection, is involved in modulating the coagulation and inflammation associated with severe sepsis. Recombinant human activated protein C (APC), or drotrecogin alfa (activated), shares the intrinsic pharmacologic activity of endogenous APC. In the Recombinant Human Activated Protein C Worldwide Evaluation in Severe Sepsis (PROWESS) trial, drotrecogin alfa (activated) decreased absolute mortality by 6% and relative risk of mortality by 19% compared with placebo. Drotrecogin alfa (activated) is an important advancement in the treatment of adult patients with severe sepsis.
PMID: 12492225 [PubMed - indexed for MEDLINE]

Xigris [drotrecogin alfa (activated)] due to failure to show

a survival benefit
Safety Announcement

[10-25-2011] The U.S. Food and Drug Administration (FDA) is informing healthcare professionals and the public that on October 25, 2011, Eli Lilly and Company announced a worldwide voluntary market withdrawal of Xigris [drotrecogin alfa (activated)]. In a recent study, Xigris failed to show a survival benefit for patients with severe sepsis and septic shock. 
Xigris treatment should not be started in new patients. Xigris treatment should be stopped in patients being treated with Xigris. 
All remaining Xigris product should be returned to the supplier from whom it was purchased. 
In a recently completed clinical trial (PROWESS-SHOCK trial), Xigris failed to show a survival benefit. In this trial of 1696 patients, 851 patients were enrolled in the Xigris arm and 845 patients were enrolled in the placebo arm. Results based on preliminary analyses done by Eli Lilly and Company, that were submitted to the FDA, showed a 28-day all cause mortality rate of 26.4% (223/846) in Xigris-treated patients compared to 24.2% (202/834) in placebo-treated patients, for a relative risk of 1.09; 95% CI (0.92, 1.28), and P-value = 0.31 (not statistically significant). 

http://www.fda.gov/drugs/drugsafety/ucm277114.htm