Презентация на тему E. coli бактериясынан плазмидалық ДНҚ молекуласын бөліп алу

Плазмидалық ДНҚ-ны экстракциялау әдістері

термині енгізілді

Плазмида – екі тізбекті сақиналы ДНҚ молекуласы,

хромосаманың геномынан физикалық түрде бөлек тұратын және өз бетінше репликацияланатын кішкентай ДНҚ молекулалар.

мыңнан 100 мыңға дейін жұп негіздерінен тұрады

(R-плазмиды)
Энтеретоксиннің синтізі - Ent-плазмида
Ультракүлгін сәулесіне төзімділігі;
Рестрикция-модификациялы жүйесі;

Үлкен көлемде бөлу «maxiprep», жақсы сапалы пДНҚ экстрациялау

болады. Төмен бағалы және тез әдіс.
Ораташа көлемде бөлу «midiprep»
Кішкентай көлемде бөліп алу «miniprep»

ортада 3LB+Amp 7ºС-та өсіреміз (20-24 сағат)

Жасушаны лизиска ұшыру. Қайнату

арқылы лизистеу (Holmes, Quigley, 1981) және сілті арқылы лизистеу (Birnboim, Doly, 1979), жоғары әсерлілігімен және аз плазмидаларға пайдалануға болатындығымен ерекшеленеді (≤10 kb) 2-3 мг/л. ЭДТА – сыртқы мембрананы босатып, нуклеаза лизоцимін ингибирлеп, клетка қабықшасын бұзады. SDS –тің әсерімен лизистеу (Godson, Vapnek, 1973) салыстырмалы жұмсақ әрі үлкен плазмидаларда қолдануға болады (≥10 kb). SDS - цитоплазматикалық мембрананы бұзып, белоктарды денатурацияға ұшыратып, нуклеазаларды ингибирлейді.

Сілтілі реагент ретінде 0.2 н NaOH қолданылады.

геномдық және плазмидалық ДНҚ қоспасының рН-ты сілтілі жаққа өзгертеді.

Осы кезде ДНҚ толығымен денатурацияға ұшырайды, бірақ палзмидалық ДНҚ өзгермейді. Оның себебі плазмидалық ДНҚ сақиналы болып келегендіктен арасындаығы байланыс сілтілі реагентерге тұрақты болып келеді.

келеді. Қайтымсыз денатурацияланаған пДНҚ сиквенске қолдануға болады, бірақ рестриктаза

ферменттері оны танымайды.

пДНҚ

20-24 часа в 100-500ml богатой среды: 37oС, 200-300rpm;
ЦФ 4oС,

10-15', слить среду;
ЦФ 4krpm, 1', отсосать остатки жидкости;
ресуспензировать в 10(5)ml раствора "I";
+ 1(0.5)ml свежеприготовленного раствора лизоцима (10mg/ml в р-ре "I");
NT, 15';
+ 20(10)ml раствора "II", вылить резко, смешать:
0oС, 5';
+ 10(5)ml холодного 10М AcONH4 (добавлять 5 ml пипеткой по каплям), смешать;
0oС, 5';
ЦФ 5krpm, 4oС, 10';
супер снять, разделить на 2 пробирки, добавить к каждой по 12.5 ml изопропанола. Делать это на весах, чтобы пробирки имели равный вес;
NT, 10';
ЦФ 5krpm, 4oС, 10', сбросить супер;
ЦФ NT, 3', отсосать остатки жидкости (не подсушивать);
cуспендировать осадок в 800µl 2 M AcONH4, объединить в одной 2ml пробирке;
NT, 5';
ЦФ NT, 10';
cупер перенести в пробирку с 800µl изопропанола;
NT, 5';
ЦФ NT, 5';
сполоснуть 70% EtOH;
растворить в 0.2-1ml H20.

37oС, 200-300rpm;
1.5ml ночной культуры поместить в 1.7ml пробирку,

ЦФ 30'', удалить супер;
п.2. - ещё 2 раза;
ЦФ 10'' дополнительно, отсосать остатки среды;
ресуспензировать осадок в 200µl раствора "I", вортекс 5'';
NT, 5';
+ 400µl раствора "II", резко вылить, сразу же резко встряхнуть, перевернуть ~5 раз;
0oС , 5' (не больше!!!);
+ 200µl холодного 10М AcONH4, ~5 раз перевернуть;
0oС, 5';
ЦФ NT, 5';
супер перенести в пробирку с 500µl изопропанола, смешать;
NT, 10';
ЦФ NT, 10', сбросить супер;
ЦФ NT, 0.5-1', сбросить остатки изопропанола (не подсушивать);
+ 100µl 2М AcONH4, вортекс 20'';
NT, 5';
ЦФ NT, 5', перенести супер в пробирку со 100µl изопропанола;
NT, 10';
ЦФ NT, 10';
сполоснуть осадок 70% EtOH (~200µl), подсушить
растворить в 25µl (H20 или TE).

Выделение pDNA (минипреп - лизис щелочью).

тексері үшін, не плазмиданың көлемін өлшеу үшін қолдануға болады.

растить ночную культуру 16-24 часа в богатой среде: 37oС, 200-300rpm;
0.2ml ночной культуры поместить в 1.7ml пробирку;
ЦФ 30'', удалить супер;
ресуспензировать осадок в 40µl 1х TE (или TAE), вортекс 5'';
добавить:40µl Ф:Х, 4µl 10х SDS(+)-буфера для внесения;
вортекс 20'';
ЦФ 5';
15-20µl водной фазы на форез.

объём до 540µl (H2O или TE),
Добавить0.800g CsCl; 60µl EtBr 10mg/ml;
Смешать,

NT, 5';
ЦФ NT, 10';
Перенести водную фазу в полипропиленовую ультроцентрифужную пробирку для ротора TLS-55; наслоить поверх последовательно по 0.73ml растворов "p2" и "p1";
Уравновесить пробирки (вместе с бакетами) попарно на точных весах (с точностью до 1mg);
ЦФ на Optima TL-100 (Beckman) 55krpm, NT, >12h (лучше ~24h);
Собрать в 1-2ml шприц суперскрученную pDNA (нижняя полоса), перенести в 1.5ml пробирку;
Несколько раз (до исчезновения окраски) экстрагировать раствором "изопропанол /CsCl";
Очистка от CsCl:
Разбавить H2O в 3 (а лучше в 6) раз и осадить 1х объёмом EtOH (мягко смешать, преципитат промыть 75% EtOH, дважды перенося типом в новую пробирку);
Подсушить, растворить в H2O или TE, спектрофотометрически определить концентрацию.

және этидиум бромидпен (EtBr) аралысады.
EtBr екі тізбекті ДНҚ

молекуласына енеді (интеркаляцияға ұшырайды), осы кезде ДНҚның баусыздануы жүреді. EtBr интеркаляцияға байланысты ДНҚ тығыздығы азаяды, сондықтан тізбекті ДНҚмыз ковалентті байанысқан сақиналы ДНҚға қарағанда салмағы азаяды, өйткені EtBr сақиналы тізбекпен аз мөлшері ғана байланысады. Салмағынадағы айырмашылық болғандықтан екеуі бір бірінен ажырасылады. Интеркаляция процессі ДНҚ молекуласының геометриясын өзгертіп ақуыздардан босатуынан көмектеседі.