Презентация на тему Методы определения белка в тканях животных без минерализации пробы

белка биуретовым методом;
Определение массовой доли белка методами, основанными на

связывании красителей;
Определение массовой доли белка методами УФ- спектрофотометрии.

ЦЕЛЬ: изучить фотометрические методы определения общего белка в мясе убойных животных без предварительной минерализации проб.

ткани, методом Лоури, биуретовым методом или методом, основанным на

связывании красителей белками, образец предварительно тщательно измельчают сначала ножом на часовом стекле или на мясорубке, а затем на гомогенизаторе.
Для приготовления щелочного экстракта 15 г гомонизированного образца взвешивают в колбе Эрленмейера вместимостью 100 см3, прибавляют 20 см3 дистиллированной воды и 10 см3 раствора гидроксида натрия молярной концентрацией 1 моль/дм3. С помощью воды суспензию переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят до метки дистиллированной водой и хранят 12 ч в холодильнике. После этого 75 см3 экстракта (из верхней части колбы) фильтруют через бумажный фильтр диаметром 15 см, удаляя первые 15 см3 фильтрата.
При определении массовой доли белка в образцах мышечной ткани убойных животных методами УФ-спектрофотометрии образцы предварительно тщательно измельчают сначала ножом на часовом стекле или на мясорубке, а затем на гомогенизаторе.

Подготовка проб к анализу:

2% в растворе NaOH молярной концентрацией 0,1 моль/ дм3.
Реактив

В: раствор CuSO4×H2O массовой долей 0,5% в растворе тартрата натрия с массовой долей 1%.
Реактив С: получают смешиванием 60 см3 реактива А и 1см3 реактива В (готовят непосредственно перед определением).
Реактив Д: непосредственно перед использованием реактив Фолина - Чокалтеу титруют по фенолфталеину раствором гидроксида натрия известной молярной концентрации и по полученным результатам разбавляют до концентрации раствора 1 моль/дм3.

1 Определение массовой доли белка методом Лоури 1.1Метод Лоури в модификации Дэвени и Гергей (1976 г)

5-100 мкг белка, прибавляют 1 см3

реактива С, смешивают и через 10 мин быстро вносят 0,1 см3 реактива Д, встряхивают и оставляют при температуре 20±5°С на 30 мин, а затем снимают показания на спектрофотометре при длине волны 750 нм.

1.1 Метод Лоури в модификации Дэвени и Гергей (1976 г)

калибровочному графику, который строят с использованием раствора тирозина известной

концентрации. Для приготовления стандартного раствора 20 мг кристаллического тирозина растворяют в 200 см3 раствора соляной кислоты молярной концентрацией 0,2 моль/дм3. Калибровочный график строят, используя растворы тирозина с рекомендуемой массовой концентрацией:

1.1 Метод Лоури в модификации Дэвени и Гергей (1976 г)

на оси абсцисс концентрацию стандартных растворов (мкг/см3) тирозина, а

на оси ординат – значения оптической плотности при 750 нм. По графику находят концентрацию тирозина, которая соответствует найденной оптической плотности.

1.1 Метод Лоури в модификации Дэвени и Гергей (1976 г)

Рисунок 1 – Калибровочный график для определения белка по методу Лоури в модификации Дэвени-Гергей.

концентрацией 1 моль/дм3, NaOH молярной концентрацией 1 моль/дм3 и

CuSO4 с массовой долей 0,5% (содержит 1% тартрата калия-натрия) в соотношении 10:5:1.
Порядок проведения анализа.
В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 2-5 см3 щелочного экстракта белков образца, приготовленного в соответствии с прописью подготовки проб, прибавляют 15 см3 раствора тартрата калия-натрия молярной концентрацией 1 моль/дм3 и доводят объем дистиллированной водой до метки. В зависимости от массового содержания азота для фотометрического определения используют 0,2 см3 приготовленного раствора. Объем доводят до 10 см3 с помощью реактива А. По истечении 30 мин измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 750 нм. Для определения содержания азота строят калибровочный график.

1.2 Метод Лоури в модификации Ластыть (1978 г)

г сульфата меди и 0,5 г иодида калия растворяют

в 1000 см3 раствора гидроксида натрия молярной концентрацией 0,2 моль/дм3.
Порядок проведения анализа.
Щелочной экстракт белков объемом 2 см3 смешивают с 15 см3 биуретового реактива. После 30 мин инкубирования смеси при 37°С светопоглощение измеряют на спектрофотометре при длине волны 550 нм.
Контрольный метод готовят аналогично, используя вместо образца 1 см3 дистиллированной воды.

2. Определение массовой доли белка биуретовым методом

разведений стандартного раствора белка, в качестве которого используют кристаллический

сывороточный альбумин: 0,01 г белка растворяют в 100 см3 дистиллированной воды, отбирают 1 см3 и доводят объем до 10 см3.
С пробами из каждого разведения белка проводят биуретовую реакцию в условиях, соответствующих описанию метода, и измеряют оптическую плотность окрашенных растворов. Затем строят график D=f(c), пример которого приведен на рисунке 2.

2. Определение массовой доли белка биуретовым методом

Рисунок 2 – Калибровочный график для определения белка биуретовым методом.

амидочерного 10В, 21 г лимонной кислоты и 2,5 см3

пропионовой кислоты растворяют в 1000 см3 дистиллированной воды.
Порядок проведения анализа.
Смешивают 2 см3 щелочного экстракта, содержащего мясные белки, с 25 см3 раствора красителя амидочерного 10В.
После проведения цветной реакции в течение 1 ч раствор центрифугируют в течении 10 мин при 100 с-1. Абсорбцию прозрачного супернатанта определяют на спектрофотометре при длине волны 615 нм. Массовую долю белка определяют по калибровочному графику.

3. Определение массовой доли белка методами, основанными на связывании красителей 3.1 Метод с использованием амидочерного 10В

г очищенного красителя растворяют в фосфатном буфере молярной концентрацией

0,05 моль/дм3 и доводят объем до 1 дм3.
Фосфатный буфер молярной концентрацией 0,05 моль/дм3 (pH= 1,8-1,9): 3,4 г KH2PO4, 3,4 см3 H3PO4 (массовой долей 85%), 60 см3 уксусной кислоты, 1 см3 пропионовой кислоты и 2 г щавелевой кислоты растворяют в 800 см3 H2O и затем доводят водой до 1 дм3. Щавелевую кислоту и KH2PO4 предварительно растворяют отдельно в горячей воде.

3.2 Метод с использованием оранжевого кислого 12

г белка, добавляют из мерной колбы 250 см3 раствора

лимонной кислоты концентрацией 0,1 моль/дм3 и гомогенизируют в течение 2-3 мин.
Взвешивают 2-4 г разбавленного образца с точностью до 0,01 г в пробирки 50 мл, добавляют воду до 5 г, а затем 25 см3 раствора красителя, закрывают пробкой и энергично встряхивают. Оставляют на 30 мин для взаимодействия красителя с белком и агрегации образовавшихся комплексов. Если смесь мутная, то ее центрифугируют и фильтруют. Определяют концентрацию свободного несвязавшегося красителя, измеряя абсорбцию при длине волны 475 нм. Для расчета используют стандартный график, который строят на основе анализа мяса методом Кьельдаля того же состава, что и анализируемый образец.

3.2 Метод с использованием оранжевого кислого 12

Рисунок 3 – отношение содержания свободного красителя к общему содержанию белка в образце свиной колбасы, определенному по методу связывания красителя.

см3 раствора лимонной кислоты молярной концентрацией 0,1 моль/дм3 в

гомогенизаторе в течение 2-3 мин, переносят в пробирку.
В пробирку добавляют 9,5 см3 раствора мочевины молярной концентрацией 8 моль/дм3 в растворе гидроксида натрия молярной концентрацией 2 моль/дм3, встряхивают, центрифугируют при частоте вращения 83 с-1 в течение 7 мин для отделения жира и измеряют оптическую плотность при длине волны 243 нм.
Массовую долю белка определяют, используя калибровочный график или уравнение регрессии (для чего предварительно определяют массовую долю белка по методу Кьельдаля).
Уравнение регрессии, например, для соленой говядины имеет вид:
у=17,32х+1,025,
где у – массовая доля белка, %;
х- оптическая плотность (х=D при длине волны 243 нм)

4. Определение массовой доли белка методами УФ- спектрофотометрии 4.1 Метод определения массовой доли белка в говядине

измельченный суспендируют в гомогенизаторе в течение 5 мин со

100 см3 раствора лимонной кислоты, затем с помощью пипетки вносят 0,5 см3 суспензии в центрифужную пробирку, добавляют 9,5 см3 раствора карбамида, содержащего гидроксид натрия, и после осторожного перемешивания центрифугируют в течение 3 мин при частоте вращения 116-117 с-1. Заполняют кварцевую кювету с толщиной светопоглощающего слоя 1 см прозрачной жидкостью и измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 241 нм.
В качестве контрольного раствора используют смесь из 0,5 см3 раствора лимонной кислоты молярной концентрацией 0,1 моль/дм3 и 9,5 см3 щелочного раствора мочевины.
Массовую долю белка определяют, используя калибровочный график или приведенное выше уравнение регрессии. Пробы с различной массовой долей белка рекомендуется готовить путем смешивания гомогенизированного куриного мяса со свиным жиром в различных соотношениях.

4.2 Метод определения массовой доли белка в мясе птицы

(см. п. 4,2), но с использованием других длин волн

и других калибровочных графиков. Возможно также использование уравнений регрессии:
для свинины: у=-13,7282+63,8762х;
для говядины: у=6,9999+34,8326х.

Результаты определения массовой доли белка в объектах исследования с использованием метода Лоури, биуретового метода и метода связывания красителей белками рекомендуется оформлять в виде таблицы:



Результаты определения массовой доли белка в объектах исследования с использованием метода УФ-спектрофотометрии рекомендуется свести в таблицу:

4.3 Метод определения массовой доли белка в свинине и говядине

делают выводы и составляют общее заключение по работе. На

базе литературных данных и результатов собственных исследований рекомендуется дать сравнительную характеристику сырья и продуктов по содержанию белка, а также прокомментировать преимущества и недостатки предлагаемых методов анализа белков мяса и мясопродуктов.

Заключение:

/ Л.В. Антипова, И.А. Глотова, И.А. Рогов.- М.: КолосС,

2004. – 571с.
Журавсткая Н.К. исследование и контроль качества мяса и мясопродуктов / Н.К. Журавская, Л.Т. Алехина, Л.М. Отряшенкова. – М.: Агропромиздат, 1985. – 296с.
Химия пищи. Кн.1: Белки: структура, функции, роль в питании / И.А. Рогов, Л.В. Антипова, Н.И. Дунченко и др. – М.: Колос, 2000. – 384с.

Список литературы: