Что такое findslide.org?

FindSlide.org - это сайт презентаций, докладов, шаблонов в формате PowerPoint.


Для правообладателей

Обратная связь

Email: Нажмите что бы посмотреть 

Яндекс.Метрика

Презентация на тему Методы выделения нуклеиновых кислот

Содержание

Геномный материал прокариот
Методы выделения нуклеиновых кислот Геномный материал прокариот Геномный материал эукариот Основные этапы выделения ДНК из биологических образцовПолучение биологического образцаРазрушение клеточной стенки, капсулы, -  Венозная кровь – центрифугирование образца и отбор ядросодержащих клетокКультура клеток 2. Разрушение клеточной стенки, капсулы, биологических мембранСтроение биологической мембраныTris-HCl – поддержание постоянства 3. Депротеинизация Протеиназа К – удаления белковой примеси в препаратах нуклеиновых кислот, Освобождение нуклеиновых кислот от детергента, солей- Используют AcNa + изопропиловый спирт или Подведение итогов:Для выделния ДНК нужно получить лизат клеток, осветлить его центрифугированием (удаляем Очистка препарата ДНК Потенциальные ингибиторы ПЦР 1. Фенол-хлороформная экстракция (удаление белков), спиртовое осаждение ДНК (изопропанол, этанол)2. Хроматография (гель-фильтрация, ХроматографияГель-фильтрацияИонно-обменная хроматографияСелективная адсорбцияАффинное связывание – использование биотин меченых праймеров,с последующей стрептовидиновой акцепцией ДНК В чем различия между методами выделения геномной и плазмидной ДНК?Основные стадии – Виды биологических образцов Выделение ДНК из различных объектовВарьируют методики лизиса (использование дополнительных ферментов, подбор детергента). Метод иммуномагнитной сепарации5-10 грамм кал 200 мл Hanks буфер.Фильтрация гомогенезата. нейлоновый фильтр Проверка качественного и количественного выхода ДНК1. Гель-электрофорез (агароза,ПААГ)2. Спектрофотометрия Спектрофотометрическое измерение концентрации ДНК Гель-электрофорез А ТЕПЕРЬВСЕ НА ПРАКТИКУМ!!!
Слайды презентации

Слайд 2 Геномный материал прокариот

Геномный материал прокариот

Слайд 3 Геномный материал эукариот

Геномный материал эукариот

Слайд 4 Основные этапы выделения ДНК из биологических образцов
Получение биологического

Основные этапы выделения ДНК из биологических образцовПолучение биологического образцаРазрушение клеточной стенки,

образца
Разрушение клеточной стенки, капсулы, биологических мембран
Удаление белков (депротеинизация)
Очистка, переосаждение,растворение

ДНК
Проверка качественного и количественного выхода ДНК

Слайд 5 - Венозная кровь – центрифугирование образца и

- Венозная кровь – центрифугирование образца и отбор ядросодержащих клетокКультура клеток

отбор ядросодержащих клеток

Культура клеток в среде – центрифугирование,отбор питательной

среды (для культур бактерий, выращенных в жидкой среде); отделение клеток от подложки, центрифугирование (для культур эукариотических клеток)
Бактериальная культура на чашке Петри – забор материала при помощи микробиологической петли

1. Получение биологического образца (клеток, содержащих генетический материал)


Слайд 6 2. Разрушение клеточной стенки, капсулы, биологических мембран
Строение биологической

2. Разрушение клеточной стенки, капсулы, биологических мембранСтроение биологической мембраныTris-HCl – поддержание


мембраны
Tris-HCl – поддержание постоянства рН (необходимо для работы лизоцима,

а также дл сохранения целостности ДНК)
ЭДТА – хелатирующий агент (связывает двухвалентные ионы, в т.ч. ионы Mg2+
– кофакторы
ДНКаз )
Детергент
( тритон Х -100,CTAB,
SDS) – солюбилизация мембраны, денатурация белков
Дополнительно:
Лизоцим – мурамидаза, осуществляет гидролиз пептидогликана клеточной стенки бактерий муреина
Нагрев до 650С-900С

Солюбилизация
мембраны


Слайд 7 3. Депротеинизация

Протеиназа К – удаления белковой примеси

3. Депротеинизация Протеиназа К – удаления белковой примеси в препаратах нуклеиновых

в препаратах нуклеиновых кислот, расщепление и инактивация нуклеаз в

препаратах ДНК,
устойчива ко многим денатурирующим агентам, таким как додецил-сульфат натрия и мочевина, повышающим доступность пептидных связей белков для протеиназы К

Удаление белков

Необратимое осаждение связано с глубокими внутримолекулярными изменениями структуры белка, что приводит в потере ими нативных свойств (растворимости, биологической активности и др.).Денатурация белков при помощи фенола (рН 7,5) с последующим его удалением смесью фенол-хлороформ, хлороформом

Денатурация


Слайд 8 Освобождение нуклеиновых кислот от детергента, солей
- Используют AcNa

Освобождение нуклеиновых кислот от детергента, солей- Используют AcNa + изопропиловый спирт

+ изопропиловый спирт или AcNa + 96% этиловый спирт–

образование осадка нуклеиновых кислот
- 70% этанол – дополнительная промывка образовавшегося осадка ДНК от солей
- Центрифугирование
Растворение ДНК в ddH2O
Хранить при -200С

4. Переосаждение и растворение ДНК


Слайд 9 Подведение итогов:
Для выделния ДНК нужно получить лизат клеток,

Подведение итогов:Для выделния ДНК нужно получить лизат клеток, осветлить его центрифугированием

осветлить его центрифугированием (удаляем мембрану, клеточную стенку, капсулу)
Очистить ДНК,

поскольку в препарате могут содержаться ДНКазы, ингибиторы лигаз, рестриктаз, Taq-полимеразы


Слайд 10 Очистка препарата ДНК Потенциальные ингибиторы ПЦР

Очистка препарата ДНК Потенциальные ингибиторы ПЦР

Слайд 11 1. Фенол-хлороформная экстракция (удаление белков), спиртовое осаждение ДНК

1. Фенол-хлороформная экстракция (удаление белков), спиртовое осаждение ДНК (изопропанол, этанол)2. Хроматография

(изопропанол, этанол)
2. Хроматография (гель-фильтрация, ионообменная хроматография,селективная адсорбция) – метод

часто используется в коммерческих наборах для выделения ДНК
3. Центрифугирование в градиенте хлористого цезия

Методы очистки нуклеиновых кислот


Слайд 12 Хроматография
Гель-фильтрация
Ионно-обменная хроматография
Селективная адсорбция
Аффинное связывание – использование биотин меченых

ХроматографияГель-фильтрацияИонно-обменная хроматографияСелективная адсорбцияАффинное связывание – использование биотин меченых праймеров,с последующей стрептовидиновой акцепцией ДНК


праймеров,с последующей стрептовидиновой акцепцией ДНК


Слайд 13 В чем различия между методами выделения геномной и

В чем различия между методами выделения геномной и плазмидной ДНК?Основные стадии

плазмидной ДНК?
Основные стадии – одинаковы (получение лизата, депротеинизация, преципитация

ДНК)
При выделении геномной ДНК используются более мягкие методы лизиса (НЕ используется нагревание, щелочной лизис) для сохранения целостности ДНК (геномная ДНК имеет большие размеры по сравнению с плазмидной, легко рвется при действии температуры, рН, при механическом воздействии)
При выделении геномной ДНК следует избегать интенсивного пипетирования раствора ДНК, а также нельзя использовать узкие наконечники для пипеток
Подсушивать препарат высокомолекулярной ДНК следует БЕЗ подогрева
Растворять такой препарат следует аккуратно, без встряхивания пробирки

Слайд 14 Виды биологических образцов

Виды биологических образцов

Слайд 15 Выделение ДНК из различных объектов
Варьируют методики лизиса (использование

Выделение ДНК из различных объектовВарьируют методики лизиса (использование дополнительных ферментов, подбор

дополнительных ферментов, подбор детергента). Пример:
- для выделения ДНК

из грибов и растений используют CTAB (цетилтриметиламмоний бромид) – позволяет избавиться от полисахаридов и соединений фенольной природы – в буфере с низкой ионной силой преципитирует ДНК, в то время как полисахариды и фенольные соединения остаются в растворе


Слайд 16 Метод иммуномагнитной сепарации
5-10 грамм кал
200 мл Hanks

Метод иммуномагнитной сепарации5-10 грамм кал 200 мл Hanks буфер.Фильтрация гомогенезата. нейлоновый

буфер
.
Фильтрация гомогенезата. нейлоновый фильтр dпоры= 220 мкм
Разделение гомогенезата.
5 порций

по 40мл + 40мкл ММС. Инкубация 30 мин.

Инкубация в магнитном сепараторе на горизонтальной платформе шейкера 15 мин

1 – ММС с колоноцитами после коньюгации Аг(колоноцит)+Ат(ММС)
2 – ММС без колоноцитов

1

2

Выделение ДНК из колоноцитов

Matsushita H, Matsumura Y, Moriya Y, Akasu T, Fujita S, Yamamoto S, Onouchi S, Saito N, Sugito M, Ito M, Kozu T, Minowa T, Nomura S, Tsunoda H, Kakizoe T: A new method for isolating colonocytes from naturally evacuated feces and its clinical application to colorectal cancer diagnosis. Gastroenterology 2005;129:1918-1927


Слайд 17 Проверка качественного и количественного выхода ДНК
1. Гель-электрофорез (агароза,ПААГ)
2.

Проверка качественного и количественного выхода ДНК1. Гель-электрофорез (агароза,ПААГ)2. Спектрофотометрия

Спектрофотометрия


Слайд 18 Спектрофотометрическое измерение концентрации ДНК

Спектрофотометрическое измерение концентрации ДНК

Слайд 19 Гель-электрофорез

Гель-электрофорез

  • Имя файла: metody-vydeleniya-nukleinovyh-kislot.pptx
  • Количество просмотров: 112
  • Количество скачиваний: 2