Презентация на тему Молекулярное клонирование: основные вектора и штаммы

с кусками хозяйской ДНК – «клонирование» (60-е годы)
60-е и

70-е гг – открытие и изучения явления Рестрикции-Модификации. (Лурия, Арбер, Янг)

открытие эндонуклеаз рестрикции
Классификация. Три типа
Тип II – наше все. Номенклатура.
EcoRI:
E(scherichia) co(li) R – 1

Открытие полимеразной цепной реакции

вектора
Приготовление ДНК для клонирования
Создание рекомбинантной ДНК
Введение

рекомбинантной ДНК в штамм-хозяин
Селекция клонов (организмов), содержащих рекомбинантную ДНК
Скрининг клонов на наличие нужной ДНК

цепная реакция
Обратная транскриптаза

ДНК-лигаза – второй ключевой фермент в молекулярном

клонировании.

Особенность ДНК-лигазы фага Т4

Реже используемые: фосфатаза, киназа, ДНК-полимераза…

рестрикция, ПЦР-скрининг, гибридизация.
Пример, плазмида pUC19

штамма-хозяина.
E.coli с генотипом lacZ′ ΔM15 – дефектная бета-галактозидаза.

фенотипическая селекция (альфа-комплементация)
Выбор и приготовление вектора
Полилинкер – набор возможных рестриктаз. Гидролиз с последующей очисткой.
Приготовление ДНК для клонирования
ДНК, с липкими концами как у вектора
Создание рекомбинантной ДНК
«сшивка» вектора и ДНК для клонирования
Введение рекомбинантной ДНК в штамм-хозяин
приготовление компетентных клеток E.coli соответствующего штамма
трансформация лигазной смесью компетентные клетки
Селекция клонов (организмов), содержащих рекомбинантную ДНК
антибиотик – ампициллин, фенотипическая селекция «белые-синие»
Скрининг клонов на наличие нужной ДНК
рестрикционный анализ, гибридизация с зондами, ПЦР-скрининг

Плазмиды, в зависимости от целей клонирования могут нести множество специальных
районов. Это, например, терминаторы, промоторы, последоваетльности Козака, полилинкеры, вспомогательные гены и другие..

можно посмотреть, например, в фирмах, продающих клетки:
http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/competent_cells/genetic_markers.asp
Важно знать какие

мутации нужны в каких экспериментах.
Можно составить список штаммов с их свойствами. Например: