Слайд 2
Потребности культур клеток в питательных и др. веществах
Каждый
конкретный вид организмов, используемых в биотехнологии, строго избирателен к
питательным веществам, что определяется физиологическими особенностями данного вида.
В зависимости от того, что является источником энергии и питания для данного типа организмов, для них конструируют специальные питательные среды.
Слайд 3
Физиологические потребности клеток в питательных веществах можно выявить
в приближенном виде, определив химический состав клеток.
Однако в этом случае не учитываются количество и состав метаболитов, удаленных клеткой во внешнюю среду, и то обстоятельство, что состав клеточного вещества живых организмов зависит от условий среды обитания и варьирует в достаточно широких пределах.
Но все же, первоначальную ориентировку в выборе состава питательной среды, исходя из состава клеточного вещества клетки, сделать можно!
Слайд 4
Исходя из строения и состава клеточного вещества, можно
судить о необходимых для этого организма питательных веществах, которые
должны присутствовать в питательной среде.
Соотношение отдельных химических элементов, необходимых для нормального роста и развития данного организма, может заметно колебаться в зависимости от вида организма и условий его роста.
Слайд 5
Однако есть общие закономерности и основные химические элементы,
необходимые для всех без исключения микроорганизмов и потребляемые в
процессе метаболизма в относительно больших количествах: УГЛЕРОД, АЗОТ, КИСЛОРОД и ВОДОРОД!
Кроме того, все микроорганизмы нуждаются в фосфоре, сере, калии, натрии, магнии и др. макро- и микроэлементах.
Слайд 6
УГЛЕРОД, имеющий наибольшее биогенное значение среди всех элементов,
входит в состав почти всех соединений, из которых построены
живые организмы.
Доля углерода в составе биомассы микроорганизмов составляет около 50%.
В зависимости о источника углерода, необходимого для конструктивного метаболизма, микроорганизмы делят на две группы: автотрофы и гетеротрофы.
Слайд 7
Автотрофы - организмы, синтезирующие органические вещества из неорганических
соединений (как правило, из диоксида углерода и воды).
Автотрофы
создают первичную биологическую продукцию, находясь на первом трофическом уровне в экосистемах и передавая органические вещества и содержащуюся в них энергию гетеротрофам.
Большинство автотрофов являются фотоавтотрофами, которые имеют хлорофилл. Это — растения (цветковые, голосеменные, папоротникообразные, мхи, водоросли) и цианобактерии. Они осуществляют фотосинтез с выделением кислорода, используя неисчерпаемую и экологически чистую солнечную энергию.
Хемоавтотрофы (серобактерии, метанобактерии, нитрифицирующие бактерии, железобактерии и др.) для синтеза органических веществ используют энергию окисления неорганических соединений.
Слайд 8
Гетеротрофы - организмы, использующие для питания органические вещества;
в узком смысле слова
– организмы, использующие органические соединения в качестве источника углерода.
К гетеротрофам относятся человек, все животные, некоторые растения, большинство микроорганизмов и др.
Среди гетеротрофов выделяют две большие группы: сапрофитов и паразитов.
Слайд 9
Способность к усвоению того или иного углеродсодержащего субстрата
в значительной степени определяется видом организма.
Однако можно выделить
общие закономерности.
Наиболее доступны для большинства культур соединения, содержащие полуокисленные атомы углерода в группах - СН2ОН, - СНОН -, = СОН -, то есть сахара, органические спирты (маннит, глицерин и др.) и органические кислоты. Такие вещества, с одной стороны, обладают достаточно большим запасом энергии, выделяющейся при их окислении; с другой стороны, они легко вступают в окислительно-восстановительные реакции, протекающие в клетке.
Слайд 10
Нередко источником углерода служат высокомолекулярные соединения (ВМС), например,
крахмал, целлюлоза, хитин или др.
Однако такие вещества должны сначала расщепляться на составляющие их низкомолекулярные соединения, которые далее уже вовлекаются в биохимические процессы. Расщепление (гидролиз) ВМС происходит либо в процессе предварительной обработки сырья (например, при кислотном гидролизе) или непосредственно во время ферментации с помощью ферментов, выделяемых микроорганизмами.
Слайд 11
АЗОТ, наряду с углеродом, является одним из четырех
основных компонентов, участвующих в построении клетки.
В расчете на сухое
вещество содержание азота в клетке составляет в среднем 12% у бактерий и 10% - у грибов.
Природный азот бывает в окисленной, восстановленной и молекулярной формах. Легче всего организмами усваивается азот в восстановленной форме. Однако при этом происходит подкисление в процессе ферментации культуральной жидкости, что приводит к торможению роста продуцента. Для предотвращения этого в питательные среды добавляют мел или другой нейтрализующий агент.
Слайд 12
В качестве источников азота микроорганизмы могут использовать органические
соединения: аминокислоты, пептиды, белки. Белки, как и все высокомолекулярные соединения,
потребляются после их расщепления на аминокислоты и пептиды с помощью протеиназ, поэтому расти на средах, содержащих в качестве единственного источника азота белки или продукты их частичного гидролиза (пептоны), могут лишь микроорганизмы, обладающие высокой протеолитической активностью.
Слайд 13
Наряду с пептонами используются субстраты, полученные при кислотном гидролизе
белка (чаще всего казеина), в которые входят свободные аминокислоты.
Гидролизат казеина содержит полный набор аминокислот (за исключением триптофана, разрушающегося при кислотном гидролизе) и является универсальным источником азота. При внесении гидролизата казеина в среду совместно с триптофаном клетки переключаются на так называемый «аминогетеротрофный» тип питания, потребляя аминокислоты в готовом виде. Подкисления или подщелачивания среды не происходит.
Слайд 14
Окисленные формы азота, в основном нитраты калия, натрия
или аммония, также могут потребляться многими микроорганизмами. Однако нитраты
предварительно восстанавливаются клетками с помощью последовательного действия двух ферментов: нитрат- и нитритредуктазы. Нитратный азот используется для микроорганизмов, не способных развиваться в кислой среде.
Важную группу представляют микроорганизмы, способные фиксировать молекулярный азот воздуха. Интерес представляют клубеньковые бактерии рода Rhizobium, которые в симбиозе с бобовыми растениями могут фиксировать молекулярный азот атмосферы, снабжая таким образом растения азотом.
Слайд 15
ФОСФОР необходим клеткам для синтеза ряда важнейших соединений
- коферментов, фосфолипидов, нуклеиновых кислот, АТФ и др. Органические
соединения фосфора используются микроорганизмами как аккумуляторы энергии, освобождающейся в процессе окисления. В питательной среде фосфаты должны присутствовать в виде неорганических солей: одно - или двузамещенных фосфатов калия или натрия. Реже используются органические источники фосфора, например продукты разложения нуклеиновых кислот. Довольно большое количество фосфора содержится в таком распространенном сырье, как кукурузный экстракт.
Слайд 16
СЕРА входит в состав аминокислот (цистеин, метионин), витаминов
и кофакторов (биотин, липоевая кислота, кофермент А и др.).
В
природе сера находится в форме неорганических солей (в основном – сульфатов), в виде молекулярной (элементарной) серы или входит в состав органических соединений.
Большинство клеток потребляют серу в форме сульфатов, который при этом восстанавливается до сульфидов.
Термин «факторы роста» используется для обозначения важных источников питания, таких как аминокислоты, витамины, пуриновые или пиримидиновые соединения, которые по каким-либо причинам клетки не могут синтезировать самостоятельно. Факторы роста необходимы клеткам в очень малых количествах.
Микроорганизмы, которым в дополнение к основному источнику углерода необходим один или больше факторов роста, называют АУКСОТРОФАМИ.
ПРОТОТРОФЫ не требуют ростовых факторов.
Микроэлементы, такие как медь, цинк,
кобальт, никель, хлор, натрий, кремний, молибден, марганец и др., необходимы также в малых дозах - для построения клеточных структур и нормального функционирования металлсодержащих ферментов, витаминов и др.
Предшественники вносят в питательные среды для целенаправленного увеличения выхода конечного продукта. Они обычно представляют собой синтетические соединения, входящие в состав молекулы целевого продукта.
Слайд 19
Вода составляет 80-90% биомассы клеток. Содержание воды
в растворе или в субстрате количественно выражают величиной активности
воды (aw), то есть отношением парциального давления пара раствора (р) к давлению водяного пара (р0).
Для разбавленных сред активность воды практически совпадает с концентрацией воды. Для чистой воды aw = 1,0; а для совершенно сухого вещества aw = 0.
Микроорганизмы способны развиваться на питательных средах, в которых активность воды (aw) находится в пределах от 0,63 до 0,93, причем для бактерий этот диапазон значительно уже (от 0,93 до 0,99), чем для дрожжей и микроскопических грибов.
Слайд 20
Кроме сбалансированного состава питательной среды для культивируемого продуцента
важную роль играет pH среды (водородный показатель — мера активности (в
разбавленных растворах эквивалентна концентрации) ионов водорода в растворе, количественно выражающая его кислотность. Равен по модулю и противоположен по знаку десятичному логарифму активности водородных ионов, выраженной в молях на один литр.
Слайд 21
Каждый микроорганизм имеет интервал pH среды, в пределах
которого он может развиваться. Однако есть и некоторые общие
закономерности.
Большинство бактерий хорошо развиваются при рН, близком к нейтральному (6,5-7,5).
У грибов и дрожжей оптимум рН находится в кислой зоне (4,0-6,0).
Например: при спиртовом брожении при рН 4,0 образуются диоксид углерода и этиловый спирт. При сдвиге рН до 7,5, кроме диоксида углерода и этилового спирта, образуется ещё уксусная кислота.
Слайд 22
Важным показателем является также окислительно-восстановительный потенциал rH2 -
отрицательный логарифм давления молекулярного водорода, выражающий степень аэробности культур.
В водном растворе,
полностью насыщенном кислородоми, rH2 = 41, а в условиях полного насыщения среды водородом rH2 = 0. Таким образом, шкала от 0 до 41 характеризует любую степень аэробности.
Слайд 23
По отношению к молекулярному кислороду все микроорганизмы подразделяют
на следующие основные группы: АЭРОБЫ, АНАЭРОБЫ и ФАКУЛЬТАТИВНЫЕ АНАЭРОБЫ.
Облигатные
аэробы (aeros – воздух) для осуществления процессов метаболизма нуждаются в молекулярном кислороде. Они не способны получать энергию путем брожения. Их ферменты осуществляют перенос электронов от окисляемого субстрата к кислороду.
Слайд 24
Облигатные анаэробы не используют молекулярный кислород. Более того, он
для них токсичен!
Факультативные анаэробы могут жить как при наличии, так
и в отсутствии кислорода. Типичными представителями этой группы являются кишечная палочка, стрептококк, стафилококк. Кишечная палочка на среде с углеводами развивается как анаэроб, сбраживая сахара, а затем начинает использовать кислород, как типичный аэробный организм, окисляя до СО2 и Н2О образовавшиеся продукты брожения (например, молочную кислоту).
Слайд 25
Принципы составления питательных сред
Для нормального роста микроорганизмов и биосинтеза целевых
продуктов метаболизма недостаточно только присутствия в питательной среде всех
необходимых компонентов.
Основной принцип составления питательных сред таков: Все элементы, входящие в состав клеточного вещества, должны находиться в питательной среде, причем в таких количествах, форме и соотношениях, которые клетки способны усваивать.
Слайд 26
Большое значение для биосинтеза многих целевых продуктов имеет
сбалансирован-ность питательной среды по углероду и азоту, то есть
соотношение углерода и азота C:N. Дефицит одного из этих компонентов не может быть компенсирован избытком другого.
Кроме того, из большого числа, например, источников углерода и энергии нужно выбрать именно тот, который наиболее соответствует физиологическим потребностям данной культуры.
Слайд 27
Для предварительного подбора количества компонентов питательной среды обычно
пользуются данными химического состава биомассы. Если культура синтезирует и
выделяет в среду значительные количества какого-либо продукта метаболизма, дополнительно требуется учитывать химическую формулу этого продукта. При определении количества глюкозы или другого углеродсодержащего субстрата следует учитывать, что гетеротрофы используют этот субстрат на конструктивные и энергетические нужды. Расход глюкозы на эти цели определяют по выходу АТФ.
Слайд 28
Если один из компонентов среды должен быть лимитирующим
(важно,какой элемент исчерпывается в первую очередь), то его количество
определяют по материально-энергетическому балансу, а остальные компоненты вносят в избытке.
Среды, составленные по описанным выше принципам, называют минимальными, они содержат минимум веществ, необходимых для синтеза заданного количества биомассы.
На практике обычно используют более сложные среды, способствующие интенсивному росту клеток и синтезу целевых продуктов.
Для ауксотрофов определенные факторы роста должны обязательно входить в состав минимальной среды, так как без них рост культур невозможен.
Слайд 29
«Богатая» питательная среда содержит, кроме необходимых для роста
источников питания, дополнительные вещества (аминокислоты, витамины, предшественники нуклеиновых кислот
и другие промежуточные соединения синтеза клеточных компонентов). Обогащение питательных сред приводит к увеличению скорости роста и изменению ферментного состава биомассы.
При подборе состава питательных сред часто используют математические методы планирования и обработки экспериментов, что резко сокращает трудоемкость и длительность работы.
Слайд 30
Потребности микроорганизмов в питании могут различаться качественно и
количественно в зависимости от условий культивирования. На изменение потребностей
в факторах роста способны влиять температура, рН, режим аэрации, перемешивание и др.
Для начала роста небольшого количества посевного материала требуется более обогащенная среда, чем для начала роста популяции клеток с высокой плотностью.
Слайд 31
Требования, предъявляемые к питательным средам
В среде должны быть
все необходимые для роста и развития химические элементы;
Среда должна
быть сбалансирована по химическому составу. Это значит, что соотношение химических элементов питательной среды и главным образом соотношение органогенных элементов - С:N должно примерно соответствовать этому соотношению в клетке;
Среды должны иметь достаточную влажность, обеспечивающую возможность диффузии питательных веществ в клетку. Для грибов эта влажность обеспечивается содержанием влаги в субстрате не менее 12 %, для бактерий – не менее 20 %.
Слайд 32
Среда должна иметь определенное значение рН среды. Среди
микроорганизмов различают ацидофилы (кислотолюбивые микроорганизмы), алкалофилы (щелочелюбивые микроорганизмы) и
нейтрофилы (лучше всего растут в нейтральной среде с рН около 7,0). Следует помнить, что при стерилизации среды и в процессе культивирования микроорганизмов, кислотность среды может сильно изменяться. Во избежание изменения рН в среду добавляют буферные системы (фосфатный буфер или др.), СаСО3 (для нейтрализации образующихся в результате культивирования органических кислот), вещества органической природы, обладающие буферными свойствами (аминокислоты, белки, полипептиды) и др.;
Слайд 33
Среды должны быть изотоничными для микробной клетки, т.
е. осмотическое давление в среде должно быть таким же,
как внутри клетки.
Среды должны обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом (rН2), определяющим насыщение ее кислородом. Облигатные анаэробы размножаются при rH2 не выше 5, аэробы – не ниже 10.
Среды должны быть стерильными, что обеспечивает рост чистых культур микроорганизмов.
Слайд 34
Классификация питательных сред
По консистенции питательные среды делятся на
жидкие, плотные и сыпучие.
По происхождению и составу питательные среды
делятся на натуральные (естественные), синтетические (искусственные) и полусинтетические. Натуральные среды готовятся из продуктов животного и растительного происхождения. Они содержат все ингредиенты, необходимые для роста и развития микроорганизмов. Основным недостатком этих сред является то, что они имеют сложный и непостоянный состав.
Слайд 35
Наиболее часто применяемыми натуральными питательными средами
являются мясопептонный агар (МПА) и мясопептонный бульон (МПБ), предназначенные
для культивирования бактерий, а также неохмеленное пивное сусло и сусло-агар, используемые для выращивания и накопления биомассы грибов и дрожжей.
Синтетические среды имеют в своем составе химически чистые органические и неорганические соединения в строго указанных концентрациях.
Слайд 36
Полусинтетические среды в своем составе содержат
химически чистые органические и неорганические вещества, (как и в
синтетических средах) и вещества растительного или животного происхождения в качестве факторов роста для ускорения роста и развития микроорганизмов.
По назначению среды делятся на универсальные (основные), избирательные (накопительные, элективные) и дифференциально-диагностические.
Слайд 37
Универсальные среды используются для выращивания многих
видов микроорганизмов.
Избирательные среды обеспечивают развитие только
определенных микроорганизмов или группы родственных видов и непригодны для роста других. В такие среды, как правило, добавляют вещества, избирательно подавляющие развитие сопутствующей микрофлоры.
Слайд 38
Дифференциально-диагностические среды используются для определения видовой
принадлежности исследуемого микроба, основываясь на особенностях его обмена веществ.
Состав этих сред позволяет четко выделить наиболее характерные свойства изучаемого микроорганизма.
Слайд 39
Сырье для биотехнологической промышлености
Если в лабораторных условиях продуценты
обычно выращивают на синтетических питательных средах строго определенного состава,
то в промышленности стараются использовать более дешевые и доступные натуральные виды сырья, имеющие сложный и нестабильный химический состав (в том числе отходы различных производств).
Слайд 40
Вид сырья, его количество и источник выбирают в
зависимости от:
- физиологических особенностей выращиваемой культуры (сырье
должно содержать все необходимые компоненты для роста, развития данного продуцента и биосинтеза им целевых продуктов метаболизма);
- цели культивирования;
- с учетом технико-экономических показателей (сырье должно быть дешевым, доступным и желательно возобновляемым)
Слайд 41
В биотехнологической промышленности наибольшая доля сырья (более 90 %) идет
на производство этанола. Производство хлебопекарных дрожжей требует 5 %
расходуемого сырья, антибиотики — 1,7 %, органические кислоты и аминокислоты — 1,65 %.
Ферментная биотехнология является крупным потребителем крахмала, так как только одной фруктозной патоки производится свыше 3,5 млн. т в год.
Слайд 42
С точки зрения экономики, сырье в биотехнологических производствах, особенно
в крупнотоннажных, занимает первое место в статьях расходов и
составляет 40—65 % общей стоимости продукции. При тонком биосинтезе доля сырья в общей себестоимости продукции уменьшается.
Выбор между биосинтезом и химическим синтезом вещества определяется экономическими факторами. Вот почему такую важность имеет цена сырья. В этой связи вопросы рационального использования сырья, его удешевления и повышения качества имеют особое значение.
Слайд 43
Одна из основных трудностей при реализации биотехнологических процессов
в промышленности – низкое качество и нестандартность сырья, главным
образом природного происхождения.
С другой стороны, многие виды сырья, используемые в биотехнологической промышленности, представляют собой ценные пищевые продукты (глюкоза, сахароза, лактоза, подсолнечное или соевое масло и др.). Как следствие этого, высокая стоимость и перебои в снабжении этим сырьем.
Слайд 44
Требования, предъявляемые к «идеальному» сырью
Сырье должно
быть: доступным, дешевым, иметь стандартный состав, быть стабильным при
хранении, хорошо растворяться воде, легко усваиваться микроорганизмами, не должно относиться к пищевым продуктам.
Слайд 45
Возможные пути решения «сырьевой проблемы»
Повышение эффективности использования компонентов
сырья путем предварительной его обработки (измельчение, экстракция, гидролиз, отваривание,
обогащение и др.).
Повышение уровня стандартности сырья в результате строгого соблюдения технологии выращивания и переработки сельскохозяйственных культур. Выявление и внесение в технические условия на сырье параметров, характеризующих биологическую доступность сырья.
Слайд 46
Поиск новых нетрадиционных источников сырья, в первую очередь
возобновляемых и недефицитных.
Подбор для каждого технологического процесса резервных видов
сырья (на случай перебоев со снабжением основным сырьем).
В принципе, микроорганизмы способны ассимилировать любое органическое соединение, поэтому потенциальными ресурсами для биотехнологической промышленности могут служить все мировые запасы органических веществ, включая первичные и вторичные продукты фотосинтеза, а также запасы органических веществ в недрах Земли.
Слайд 47
Однако, каждый конкретный вид микроорганизмов, используемый в биотехнологии,
весьма избирателен к питательным веществам, и органическое сырье (кроме
лактозы, сахарозы, крахмала и др.) без предварительной химической обработки малопригодно для микробного синтеза.
Принятое в настоящее время подразделение природных видов сырья на углерод- или азотсодержащее – довольно условно и основано лишь на преимущественном содержании тех или иных компонентов в сырье. Однако на практике такая классификация сырья удобна и находит широкое применение. Приведем примеры.
Слайд 48
Углеродсодержащее сырье
В биотехнологической промышленности широко применяются
меласса и гидрол — побочные продукты производства глюкозы из
крахмала. Меласса характеризуется высоким содержанием сахаров (43—57%), в частности сахарозы.
В дальнейшем необходимо учесть потенциальные возможности постоянно возобновляющихся сырьевых ресурсов — первичных продуктов фотосинтеза, в первую очередь гидролизатов древесины и депротеинизированного сока растений.
Слайд 49
В нашей стране ежегодно остается неиспользованной или нерационально
используется около 1 млн. т лактозы, содержащейся в сыворотке
и пахте.
В США из всего количества молочной сыворотки, образующейся при производстве сыра (ежегодно 20 млн. т), половина теряется со сточными водами.
В то же время известно, что из 1 т сыворотки можно получить около 20 кг сухой биомассы дрожжей. Кроме того, из сепарированной бражки можно выделить дополнительно около 4 кг протеина. Нерационально используется катофельный сок, выделяемый из картофеля при производстве крахмала, а также альбуминное молоко, получаемое из сыворотки.
Слайд 50
До недавнего времени существовало мнение, что органические кислоты
малодоступны для большинства микроорганизмов, однако на практике довольно часто
встречаются микроорганизмы, успешно утилизирующие органические кислоты, особенно в анаэробных условиях.
Низкомолекулярные спирты и кислоты (метанол, этанол, уксусная килота и др.) можно отнести к числу перспективных видов биотехнологического сырья, так как их ресурсы существенно увеличиваются благодаря успешному развитию технологии химического синтеза.
Слайд 51
Целлюлозосодержащее сырье после химического или ферментативного гидролиза и
очистки от ингибирующих или балластных примесей (фенол, фурфурол, оксиметилфурфурол
и др.) также может быть использовано в биотехнологическом производстве.
В 1939 г. В. О. Таусоном была установлена способность разных видов микроорганизмов использовать в качестве единственного источника углерода и энергии н-алканы и некоторые фракции нефти.
Отличительной особенностью углеводородов по сравнению с другими видами биотехнологического сырья является низкая растворимость в воде. Этим объясняется тот факт, что только некоторые виды микроорганизмов в природе способны ассимилировать углеводороды.Максимальная растворимость н-алканов в воде около 60 мл/л при длине молекул от С2 до С4, но при увеличении цепи растворимость снижается.
Слайд 52
Азотсодержащее сырье
К наиболее дешевым и доступным
источникам азотсодержащего сырья следует отнести кукурузный экстракт, соевую муку,
гидролизаты дрожжей и др.
Кукурузный экстракт – побочный продукт крахмало-паточного производства. Его получают упариванием замочных вод из-под кукурузного зерна до содержания сухих веществ 48-50%
Слайд 53
Среды для выращивания клеток растений и животных
Помимо
источников углерода, азота и других минеральных компонентов, среда для
клеток многоклеточных организмов содержит специфические стимуляторы и регуляторы роста. Клетки растений, как правило, требуют индолуксусную кислоту, кинетин и гиббереллиновую кислоту. Клетки животных нуждаются в ростовых веществах и незаменимых аминокислотах. Клетки растений и животных более чувствительны, чем микроорганизмы, к присутствию посторонних ингредиентов, поэтому требуют химически чистых компонентов среды.
Слайд 54
Таким образом, необходимо отметить, что в области сырьевого
обеспечения биотехнологических процессов наметился переход от дефицитного и дорогого
сырья к использованию отходов различных производств, являющихся дешевым, доступным и, желательно, возобновляемым сырьем.
