Презентация на тему Электрофорез ДНК в агарозном геле

— электрически отрицательный полюс

— электрически отрицательный полюс
Куда движется ДНК? Как она заряжена?

— электрически отрицательный полюс
Куда движется ДНК? Как она заряжена?
Благодаря заряду фосфатных

— электрически отрицательный полюс
Куда движется ДНК? Как она заряжена?
Благодаря заряду фосфатных

Электрофорез (от электро- и др.-греч. φορέω — «переношу») — направленное движение коллоидных частиц или ионов под действием электрического тока

R
закон Ома:

помощи ПЦР
(одноцепочечное антитело состоит из вариабельных участков тяжелой и

Длина ожидаемого фрагмента 700 пн

?

гена в вектор

Приготовление компетентных клеток

Электропорация (внедрение) вектора с нашим

академии наук
2014
Кемерово

вектора

Лигирование - сшивание гена с вектором

Электропорация (внедрение) вектора с

ПЦР
ферментативное копирование
фрагмента ДНК

Вектор для
наработки ДНК

вида буфера

вектора

Лигирование - сшивание гена с вектором

Электропорация (внедрение) вектора с

ПЦР
ферментативное копирование
фрагмента ДНК

Вектор для
наработки ДНК

с геном
реакция лигирования
Выделение и очистка ДНК

ПЦР

Рестрикция вектора

Лигирование - сшивание

очистка ДНК

ПЦР

Рестрикция вектора

Лигирование - сшивание гена с вектором

Электропорация (внедрение)

очистка белка










Готовый белковый продукт
Выделение и очистка ДНК

ПЦР

Рестрикция вектора

Лигирование -

концентрации выделенной ДНК
13:00-13:30 – обед
13:30-14:00 – ПЦР
14:00-15:00

можно точно и быстро определить концентрацию ДНК, а также

Спектрофотометрия – физико-химический метод исследования растворов и твердых веществ, основанный на изучении поглощения в различных областях спектра.

ДНК?
Благодаря суммарному заряду всех фосфатных групп, ДНК имеет большой отрицательный заряд.
Электрофорез (от электро- и

Анод

Катод

Положительно заряженный электрод

?????

Как она заряжена?

В протонной теории кислот и оснований Брёнстеда — Лоури, кислотой называется соединение или ион, способное отдавать протон другому химическому соединению — основанию.

Впервые это явление было открыто профессорами Московского университета П.А. Страховым и Ф.Ф. Рейссом в 1809 году.

разделения, идентификации и очистки молекул ДНК и их фрагментов

фореза
(гель должен быть закрыт слоем буфера толщиной 1 мм)
Всегда

для геля
Агарозный гель
Буферный раствор
Камера для проведения горизонтального фореза

электрофоретической подвижностью и определяется несколькими параметрами

Электрофорез

электрофоретическая подвижность, крупные молекулы движутся медленнее из-за большего сопротивления
Скорость

линейная – форма III

кольцевая неповрежденная – форма I

кольцевая с одноцепочечным разрывом – форма II

30 °С изменения подвижности ДНК не наблюдаются
Электрофоретическая подвижность в

Напряженность электрического поля

Напряженность ЭП для электрофореза обычно составляет 1 – 8 В/см наилучшее разделение при 5 В/см

Это сила, действующая на точечный заряд, помещенный в данную точку поля

При более высокой напряженности могут изогнуться полосы ДНК или расплавится небольшие фрагменты ДНК

Единицы измерения: В/см

– I (Amper)

Закон Ома: I = U / R
 V=A

 A=V / R

Могут работают в двух режимах:

Постоянное напряжение

Постоянная сила тока

Напряженность электрического поля

из чередующихся остатков β-D-галактопиранозы и
3,6-ангидридо-α-1-галактопиранозы, объединённых 1→4 связью.

Точка плавления ≈ 95 °C
Точка образования геля ≈ 45 °C
Гель является термообратимым

Концентрация агарозы

молекул ДНК в смеси, можно подбором концентрации добиться их

Манипуляция с агарозой менее 1% только при +60С!!!!

при +60С.

веса) пригодных для использования в качестве стандарта молекулярных весов

1kb

100bp
+15kb
+3kb

50kb

ДНК маркер не предназначен для определения количества ДНК, однако может быть использован для приблизительной оценки путем сравнения интенсивности окрашивания фрагментов одинаковой длины.

применяют флюоресцирующий интеркалирующий краситель – бромистый этидий (EtBr)
Молекулы красителя

Максимум поглощения EtBr наблюдается при длинах волн 300 и 360 нм (УФ-излучение), а эмиссия происходит в красно-оранжевой области видимого спектра при 590 нм

флюоресценции EtBr увеличивается в 20 раз и обеспечивает высокую

Интенсивность свечения зависит от размера ДНК: чем длиннее молекула, тем интенсивнее окраска.

Бромистый этидий сильный канцероген, поэтому все операции с ним следует проводить в перчатках!!!!!!!!!!!!!!!

агарозу.
– EtBr заряжен положительно, мигрирует к катоду – тем

Гель окрашивают после электрофореза в растворе содержащим EtBr.
– дольше, так как часто требуется еще и отмывка от этидия
– хуже разрешение
+ менеше «грязи» – менее ядовито ☺

Рабочая концентрация бромистого этидия – 0,1-0.5 мкг/мл

Везде одинаковая и в геле и в буфере и в красящем растворе

Обычно готовят стандартный (стоковый) 20000x кратный раствор
1 г EtBr разводят в 100 мл дистиллированной воды.
Стоковая концентрация 10 мг/мл.

Окраска бромистым этидием (EtBr)

раствора, для того чтобы образцы сразу опускаются на дно

Состав буфер для образцов:

10x кратный стоковый раствор
50% глицерин или 70% сахароза или 25% фикол
0.25% бромфеноловый синий и/или 0.25% ксилен цианол
1x TAE буфер

Рабочая концентрация “утежелителя”:
- глицерин: 6-10 %
- сахароза: 6-7 %
- фикол: 2,5 %

движется в том же направлении, что и ДНК
* позволяет

Буфер для образцов

Состав буфер для образцов:

10x кратный стоковый раствор
50% глицерин и/или 70% сахароза и/или 25% фикол
0.25% бромфеноловый синий и/или 0.25% ксилен цианол
1x TAE буфер

2. Краситель

различную электрофоретическую подвижность

имеют различную электрофоретическую подвижность

мМ борной кислоты, 2 мМ ЭДТА
5x стоковый (1 литр)

Минусы:

Хуже разрешение

Невозможно дальше выделять и использовать образцы

Электродный буферный раствор

TAE:
1x Трис-ацетат-ЭДТА
40 мМ Трис (рН 7,6), 20 мМ уксусной кислоты и 1 мМ ЭДТА
50x стоковый (1 литр) - растворить в 600 мл дистиллированной воды:

242 г Трис основной (FW = 121)
57,1 мл ледяной уксусной кислоты
100 мл 0,5 М EDTA (рН 8,0).
Довести до конечного объема 1 л дистиллированной водой.

происходит истощение буфера
Невозможно дальше выделять и использовать образцы, т.к.

TAE:

TBE:

Исторически сложилось так, что TAE используют чаще других буферных р-рв

Электродный буферный раствор

электрофореза для разделения молекул по заряду и размеру в

Используется при секвенировании ДНК

Детектирование разделившихся молекул при капиллярном электрофорезе осуществляется специальными устройствами 

Буфер 2

Буфер 1
+
Образец

Капилляр
с электролитом

Детектор

Основное отличие от классического элетрофореза:
используется специальный электролит, а не гель

гидролиза нуклеиновых кислот.

её функция — защита клетки от чужеродного генетического материала, например, бактериофагов и плазмид.

рестрикции
Одной из первой открытой рестриктазой была HindII.
В 1978 году

последовательность нуклеотидов и разрезают двухцепочную молекулу ДНК неподалёку от

Классификация рестриктаз

При этом образуются фрагменты ДНК
либо с ровными (тупыми) концами,
либо с выступающими (липкими) 5'- или 3'-концами.

II типа, сайт узнавания для которых в большинстве случаев

Палиндром

Палиндром буквосочетание, слово или текст, одинаково читающееся в обоих направлениях. Иногда палиндромом неформально называют любой симметричный относительно своей середины набор символов.

CTT AAG

GAA TTC

5’

5’

3’

3’

от гр. palindromos бегущий обратно)
число (например, 404),
слово (например, топот или ротор
текст (например,

Отдельные палиндромические словосочетания и фразы известны с глубокой древности, когда им зачастую придавался магически-сакральный смысл

я!
Гори, печурка, - круче пирог!
Тут хорош сыр, крыс шорох

Ох и тихо! 

Примеры полиндромов

Магический квадрат с фразой
SATOR AREPO TENET OPERA ROTAS (лат. Сеятель Арепо с трудом держит колеса), читаемой во всех направлениях

- Игнац Мошелес
Музыкальные произведения:

обозначается первой прописной буквой
EcoR I – Escherichia
BamH I

реакционной смеси и температуры проведения реакции.
Буферные растворы

но бывают и исключения:

Sma I +25° С
Bcl I +50°

Инактивация

Длительность работы:
От 1 часа до 12 часов

Усливия работы рестриктаз

Длительность и температура тоже различные, но не ниже 65 ° С

входящий в состав буфера для хранения фермента, может ингибировать

Усливия работы рестриктаз

За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК фага лямбда за 1 час при 37°С (оптимальной температуре для данного фермента рестрикции ) в 50 мкл реакционной смеси.

Все рестриктазы — Mg2+-зависимы. Буферные растворы должны содержать этот ион.

менять свою специфичность. Это называется Star-активностью и отмечается звёздочкой

Star-активность *

Например, EcoRI при повышении рН и уменьшении ионной силы буфера вместо последовательности 5’- G AATTC -3’ узнаёт последовательность 5’- N AATTN -3’.

распознаванию одинаковых последовательностей, разрезающих эти последовательности в одинаковых местах.

Классификации рестриктаз

Изомеры

Изошизомеры
Гетерошизомеры (неошизомеры)
Изокаудомеры

Первый выделенный фермент для узнавания и специфического разрезания заданной последовательности, называют прототипом, а все остальные подобные рестриктазы называют изошизомерами.

Примеры:

по-другому, называют гетерошизомером (неошизомером). Изошизомеры, таким образом, являются частным случаем

Гетерошизомеры (неошизомеры)

Sma I 
GGG^CCC

Примеры:

Xma I
G^GGCCC

GGGCCC

концы, называют изокаудомерами
Изокаудомеры
Mbo I N*GATC N

BamH I G*GATC C
C CTAG*G

Примеры:

участки. При этом выступающие участки двух образующихся фрагментов комплементарны друг другу.

могут

участки. При этом выступающие участки двух образующихся фрагментов комплементарны друг другу.

могут

GGA TCC

ДНК.
Мелкощепящие рестриктазы узнают тетрануклеотид и вносят в молекулы гораздо

К мелкощепящим относятся рестриктазы Hpa II и Alu (из Arthrobacter luteus), к крупнощепящим - EcoR I (из Escherichia coli) и Hind III.

Cайт из четырех (тетра-) нуклеотидов встречаться в среднем 1 раз через каждые 256 пар оснований, а из шести (гекса-) нуклеотидов - через 4096 пар оснований.

Большинство рестриктаз II-класса узнают последовательности, содержащие от 4 до 6 нуклеотидных пар, поэтому рестриктазы делят на мелко- и крупнощепящие.

Например, в ДНК бактериофага Т7, состоящей из 40000 п. о., отсутствует последовательность, узнаваемая рестриктазой EcoR I. (G↑AATTC)

гидролиза 1 мкг ДНК в реакционной смеси 50 мкл

Хранение

Рестриктазы хранятся при -20о С в буфере с 50% глицерина.