Презентация на тему МИКРОБНАЯ ЭКОЛОГИЯ ЧЕЛОВЕКА

1% от общего количества микроорганизмов, содержащихся в образце
Принцип метода:
Посев

разведений на специальные (дифференциально-диагностические, селективные, элективные) питательные среды;
Выделение чистых культур микроорганизмов;
Изучение морфологических, физиолого-биохимических свойств;
Идентификация с использованием молекулярно-генетических методов

специального дорогостоящего оборудования и технологичных методов анализа;
отсутствие необходимости в

высококвалифицированных специалистах

Недостатки:
невозможность анализа «некультивируемых» микроорганизмов;
невозможность дифференцировать микроорганизмы со схожими фенотипическими признаками;
трудо-и времяемкий анализ;

человека;
Исследование выделенных микроорганизмов с помощью молекулярно-генетических и хемотаксономических методов
Секвенирование

генома;
Белковое профилирование с помощью MALDI-TOF MS
Анализ жирнокислотного состава

Культивирование фекалий 2 тощих африканцев и 1 тучного европейца при 212 различных условиях:
получено 32 000 колоний
методом MALDI-TOF идентифицировано 340 видов:
174 вида ранее не описанных у человека;
31 новый вид;
10 000 ранее неизвестных генов

Lagier. J.-C. et al. CMI, 2013

анализе протеома бактерий
биомаркеры, используемые для идентификации бактерий,

- рибосомные белки;
дешевый и быстрый (пробоподготовка ~20 мин) метод идентификации;
коммерческая система для идентификации микроорганизмов на базе MALDI-TOF MS (Brucker Daltonics) имеет базу данных, содержащую белковые профили боле 5 400 штаммов бактерий;
возможно анализировать другие компоненты бактериальных клеток

жирных кислот, обнаруживаемых в бактериальных клетках
Большинство бактерий синтезируют жирные

кислоты, содержащие от 10 до 19 атомов углерода
Характерной особенностью бактерий является присутствие в пальмитиновой (гексадекановой) кислоты
Существуют количественные (на уровне вида) и качественные (на уровне рода) отличия в жирнокислотном составе бактерий разных таксономических групп
Высокое содержание насыщенных и мононенасыщенных неразветвленных жирных кислот с нечетным числом атомов углерода в цепи и присутствие кислот с гидроксильной группой характерно для грамотрицательных бактерий
Грамположительные бактерии характеризуются высоким содержанием насыщенных разветвленных и неразветвленных жирных кислот с четным числом атомов углерода в цепи, а также присутствием циклопропановых жирных кислот
Разработана коммерческая система для идентификации микроорганизмов на основании анализа состава жирных кислот MIDI Sherlock Microbial Identification System, содержащая в базе данных жирнокислотные профили более 1 500 видов бактерий

к разным видам, со схожими морфологическими и физиолого-биохимическими признаками;
выявление

и идентификация «некультивируемых» микроорганизмов.

сообществ;
анализ динамики видового разнообразия сообществ

Недостатки:
невозможность таксономической идентификации микроорганизмов в

сообществе

ДГГЭ (DGGE)
денатурирующий градиентный гель-электрофорез

ТГГЭ (TGGE)
температурный градиентный гель-электрофорез

Принцип метода:
ПЦР-амплификация целевого гена (чаще гена 16S рРНК);
Разделение продуктов ПЦР методом градиентного гель-электрофореза
Каждая полоса на геле = ампликон с уникальной нуклеотидной последовательностью = определенный вид микроорганизмов;

Не всегда одна полоса соответствует одному виду микроорганизма (ампликоны с различной нуклеотидной последовательностью и одинаковой подвижностью)
Интересующие полосы можно вырезать из геля и секвенировать

и мыши, дефектной по IL-10
Bibiloni, R., Simon, M.A., Albright,

C., Sartor, B. and Tannock, G.W. (2005), Analysis of the large bowel microbiota of colitic mice using PCR/DGGE. Letters in Applied Microbiology, 41: 45–51. doi: 10.1111/j.1472-765X.2005.01720.x

рестрикционных фрагментов) 
Принцип метода:
ПЦР-амплификация целевого гена (чаще гена 16S рРНК)

с определенным набором праймеров, один или оба из которых имеют флуоресцентную метку;
Рестрикция полученного фрагмента с использованием мелкощепящих рестриктаз (сайт узнавания – 4 п.н.);
Гель-электрофорез для определения относительного количества терминальных рестрикционных фрагментов;
Каждая полоса на геле = определенный вид микроорганизмов.

Разрешающая способность метода зависит от правильности выбора амплифицируемого гена и рестрицирующего фермента;
При анализе сообществ, включающих более 50 родов бактерий, выявляется до 70 % присутствующих бактерий

гена 16S рРНК
рестриктазами TSP509I и Hpy166I (меченный праймер

8f)

Brugger SD, Frei L, Frey PM, Aebi S, Mühlemann K, et al. (2012) 16S rRNA Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism for the Characterization of the Nasopharyngeal Microbiota. PLoS ONE 7(12): e52241. doi:10.1371/journal.pone.0052241

Mühlemann K, et al. (2012) 16S rRNA Terminal Restriction

Fragment Length Polymorphism for the Characterization of the Nasopharyngeal Microbiota. PLoS ONE 7(12): e52241. doi:10.1371/journal.pone.0052241

T-RFLP анализ микробиоты носоглотки
153 младенцев с острым отитом

межгенной рРНК области)
Принцип метода:
Амплификация межгенной области 16S-23S рРНК с

праймерами, комплементарными консервативным областям концевых участков обоих генов;
Один из используемых праймеров несет флуоресцентную метку, что позволяет с помощью секвенирования определять нуклеотидную последовательность амплифицированной области;
Нуклеотидная последовательность межгенной области 16S-23S рРНК вариабельна, что предоставляет возможность дифференцировать представителей разных видов

Данный метод обладает большей разрешающей способностью для дифференциации подвидов, чем анализ нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК

(обычно гена 16S рРНК) с суммарной ДНК исследуемого микробного

сообщества;
Использование универсальных праймеров, комплементарных консервативным участкам целевого гена большинства известных прокариот;
Секвенирование полученных ампликонов:
создание библиотек клонов и секвенирование по Сэнгеру
длина одного сиквенса - ~700 п.н.
при изучении структуры бактериальных сообществ кожи различных участков тела человека с помощью данного метода было получено 112 283 полноразмерных сиквенса гена 16S рРНК (проанализировано 277 клонов для каждого образца). В сообществе, состоящем из более 1000 различных видов микроорганизмов, минорные представители могут быть не обнаружены.
высокопроизвдительное секвенирование
технологии Roche 454, Illumina/Solexa, ABI SOLiD;
длина одного сиквенса – 35-500 п.н.
количество сиквенсов после одного прочтения – от сотни тысяч до нескольких миллионов
Анализ результатов секвенирования
Mothur ( www.mothur.org ) и QIIME ( http://qiime.sourceforge.net/ )

изучения микробных сообществ;
видовая идентификация микрооргпнизмов в сообществе;
позволяет обнаруживать минорные

виды, не детектируемые с помощью секвенирования филогенетических маркеров и ряда других методов

Недостатки:
детекция и идентификация исключительно тех таксонов, специфические олигонуклеотидные зонды к которым находятся в микрочипе, невозможность выявления новых и «неожидаемых» таксонов;
можно выявить динамику численности определенного вида, но нельзя сравнить распространенность разных видов бактерий в сообществе;
Возможность неспецифической гибридизации (ложноположительные и ложноотрицательные реакции).

Принцип метода:
получение ДНК или кДНК исследуемого образца;
гибридизация с микрочипом, содержащим 100-1000 различных олигонуклеотидных зондов (обычно комплементарных гену 16S рРНК) в определенном положении

в различных образцах, от почв, загрязненных ураном, до легких

пациентов с пневмонией (олигонуклеотидные зонды к гену 16S рРНК)

HITChip (human intestinal tract chip) – детекция бактерий, обитающих в пищеварительном тракте человека
HuGChip (human gut chip) - детекция бактерий, обитающих в кишечнике человека

УНИВЕРСАЛЬНЫЕ

ВЫЯВЛЕНИЯ ОПРЕДЕЛЕННОЙ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ ГРУППЫ

СПЕЦИФИЧНЫЕ

Burkholderia PhyloChip – для выявления определенной группы (рода / вида) бактерий

Сравнительный анализ микробных сообществ кишечника пациентов во время антибиотикотерапии с использованием секвенирования филогенетических маркеров (141-149 клонов на образец) и филогенетических микрочипов показал, что в первом случае количество выявляемых бактериальных таксонов значительно ниже

Flanagan JL , Brodie EL , Weng L , Lynch SV , Garcia O , Brown R , Hugenholtz P , DeSantis TZ , Andersen GL , Wiener-Kronish JP , et al. Loss of bacterial diversity during antibiotic treatment of intubated patients colonized with Pseudomonas aeruginosa . J Clin Microbiol 45 : 1954 – 1962 ( 2007 ).

и группирование последовательностей, принадлежащих одному таксону (3) Получение консенсусной

последовательности гена 16S рРНК для каждого таксона (4) Компьютерное моделирование возможных последовательностей таксон-специфичных олигонуклеотидных зондов (5) In silico проверка специфичности разработанных зондов

Дизайн зонда для детекции микрорганизмов, обитающих в кишечнике человека

(область V4) и чипа HuGChip
Tottey W, Denonfoux J, Jaziri

F, Parisot N, Missaoui M, et al. (2013) The Human Gut Chip “HuGChip”, an Explorative Phylogenetic Microarray for Determining Gut Microbiome Diversity at Family Level. PLoS ONE 8(5): e62544. doi: 10.1371/journal.pone.0062544

образце
КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ПЦР
(ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ)
Детекция ампликонов в ПЦР-РВ:

Использование красителя, флуоресцирующего только когда он связан с двуцепочечной ДНК (SYBR Green);
Использование специфичных зондов с флуоресцентной меткой

Варианты ПЦР-РВ:
TaqMan – флуоресцентная метка на 5’-конце и «гаситель» флуоресценции на 3’-конце (эмиссия флуоресценции только после элонгации целевого фрагмента ДНК и высвобождения меченного 5’-конца)
Молекулярные маяки – олигонуклеотиды, содержащие на 5'-конце гаситель флюоресценции (нефлюоресцирующий хромофор), а на 3'-конце флюорохром; нуклеотидные последовательности, прилежащие к красителям, самокомплементарны, в результате чего в молекуле формируется структура типа «стебель-петля», и флюоресценция флюорохрома подавлена. Область петли молекулярного маяка комплементарна анализируемому продукту полимеразной цепной реакции, после образования гибрида между ним и продуктом ПЦР флюорохром начинает флюоресцировать («маяк» зажигается)

микроорганизмов в кишечнике человека с помощью ПЦР-РВ

)
Принцип метода:
Использование флуоресцентно меченных олигонуклеотидных зондов, комлементарных РНК внутри

бактериальной клетки

Детекция результатов:
флуоресцентная микроскопия (можно определить количество, морфологию и локализацию флуоресцентно меченных клеток – изучение взаимодействия с организмом-хозяина)
проточная цитометрия

Целевая молекула – 16S рРНК (консервативна, постоянно присутствует в бактериальной клетке, интенсивный флуоресцентный сигнал)

СПЕЦИФИЧНОСТЬ ЗОНДОВ

детекция широкого спектра бактерий

детекция специфических групп бактерий

Eub338
гибридизуется с большинством бактерий

ALF
гибридизуется с альфа-протеобактериями