Что такое findslide.org?

FindSlide.org - это сайт презентаций, докладов, шаблонов в формате PowerPoint.

Для правообладателей

Обратная связь

Email: Нажмите что бы посмотреть 

Яндекс.Метрика

Презентация на тему Основы биотехнологии и биомедицины

Содержание

Что такое «генная инженерия»?Раздел молекулярной генетики, занимающийся разработкой искусственных генетических систем с использованием манипуляций генами на молекулярном уровне путем конструирования рекомбинантных ДНК и РНК
Основы биотехнологии и биомедициныЛекция 2Технологии рекомбинантных ДНК Экспрессия рекомбинантных генов Что такое «генная инженерия»?Раздел молекулярной генетики, занимающийся разработкой искусственных генетических систем с «Новые направления в науке гораздо чаще создаются с помощью новых методов, а В. Гейзенберг: Профессионал это тот, кто знает основные ошибки в своей области и умеет их избегать В классической генетике и селекции – отбор среди потомства по определенным признакам Программа-максимум генной инженерии – создание жизнеспособного организма de novo по чертежам, разработанным Крейг Вентер – один из лидеров современной синтетической биологииJohn Craig Venter, born Клонирование – одно из ключевых понятий генной инженерии Что такое «клонирование»?В генной инженерии: получение «клона»: препарата идентичных молекул ДНК или Для чего нужны клоны ДНК?Для удобства проведения исследованийРаботать с индивидуальными молекулами ДНК трудно, но возможно Клонирование ДНКЦель – получение клона идентичных последовательностей1 – Объединение вектора со Выделение нуклеиновых кислотПрежде чем клонировать последовательность, необходимо выделить содержащую ее суммарную ДНК Фенольный метод выделения ДНКНейтральные значения pHКислые значения pHВодная фаза (ДНК и РНК)Водная Взаимодействие ДНК с поверхностью стеклаГуанидинизотиоцианатСорбция: кислые pH, высокая ионная силаЭлюирование: щелочные pH, низкая ионная сила Щелочной метод выделения бактериальных плазмидpH 8,0Фрагменты линейной ДНК и кольцевая плазмидная ДНКpH Разделение нуклеиновых кислотЦель: обогащение препаратов нуклеиновых кислот нужными последовательностями Аналитический электрофорез молекул ДНК в агарозном или полиакриламидном геле Калибровочная кривая для определения размеров фрагментов ДНКkb = т.п.н. =тысячи пар нуклеотидов, mm10 kb1 kb СуперскрученнаяКольцевая ковалентно-замкнутаяРелаксированнаяЛинейнаяEcoRIФормы плазмидной ДНКОдно-цепочечный разрыв ДНК Электрофоретическая подвижность разных форм плазмиды в присутствии бромистого этидияБромистый этидийРелаксЛинейнаяСупер.Увеличение отношения EtBr/ДНКПредел Ферменты, используемые в генной инженерииГенные инженеры используют элементы генетических систем, функционирующие в природе Эндонуклеазы рестрикции класса II (рестриктазы) – основной инструмент генной инженерииУзнают специфические последовательности Номенклатура рестриктаз класса IIHaeI, HaeII, HaeIII – Haemophilus aegipticus, открыты в указанной Субстратная специфичность рестриктаз класса IIПалиндромные сайты мелкощепящие: BglI (GGCC), крупнощепящие: EcoRI (GAATTC), NotI Изомеры рестриктазИзошизомеры Рестриктазы разных видов бактерий, узнающие одинаковые сайты рестрикции и одинаково Формы разрывов ДНК, образующихся под действием рестриктаз класса II«Тупые» концы5’-выступающие3’-выступающие Система бактериальной антивирусной защиты CRISPR/Cas CRISPR - Clustered regularly interspaced short Два способа «затупления» липких концов ДНКЗаполнение ДНК-полимеразойУдаление 3’->5’-экзонуклеазойили S1-нуклеазой Механизм действия T4-ДНК-лигазыВосстановление фосфодиэфирной связи между соседними остатками дезоксирибозы на месте одноцепочечного ЛинкерыЛигирование по«тупым» концамРасщепление EcoRIЛигирование по «липким» концам,клонированиеСоздание новых сайтов рестрикции на концах клонируемых молекул ДНК АдаптерыСоздание новых сайтов рестрикции на концах клонируемых молекул ДНКбез использования рестриктазЛигирование по«тупым» Щелочная фосфатаза и полинуклеотидкиназаЩелочная фосфатаза:Оптимальные значения pH - щелочныеУдаление 5’-фосфатных групп (дефосфорилирование) ДНК-зависимые ДНК-полимеразыДНК-полимераза I (Pol I) (EC 2.7.7.7) Мол. масса 109 кДа, Активности: 5’->3’-полимераза, Обратные транскриптазы (ОТ)ОТ вируса миелобластоза птиц (AMV RT) – димер, хорошо транскрибирует Три стратегии синтеза первой цепи кДНК обратной транскриптазойСлучайный праймерОлиго(dT)-праймерСпецифический праймер SMART-синтез кДНКОлиго-dC присоединяется независимо от матрицы обратной транскриптазойОлиго-dG с адаптером исходно добавлен Векторы Молекулярно-генетические конструкции, предназначенные для переноса генетического материала в клетки живых организмовВекторы для Свойства, которыми должен обладать любой векторСпособность к длительному существованию в клетках-хозяевах (репликация Плазмидные векторы Плазмидный вектор pUC18bla – Ген β-лактамазы, селектируемый маркер (устойчивость ампициллину)ori – Точка Плазмидный вектор BluescriptPromegaФагмида (Phagemid)Заражение бактериальных клеток, содержащих фагмиды, фагом-помощником, приводит к синтезу TA-Клонирование продуктов ПЦРTaq-ДНК-полимераза образует в продукте ПЦР 3’-выступающие A-концы независимо от матрицы Структура бактериального гена и его некоторых сильных промоторовterminatorРегуляторная часть генаСтруктурная часть гена Регуляция экспрессии генов в векторе pETБактериальнаяклетка BL21DENovagene Искусственные хромосомы Искусственная хромосома дрожжей YAC (Yeast Artificial Chromosome)>2000 т.п.н.ura3 – ген оротидин-5’-фосфатдекарбоксилазыжизненноважный: позитивный Бактериальная искусственная хромосома (BAC)CmroriSrepEparAparBparA, parB – контроль числа копий (1-2)Cmr – селектируемый Емкости векторов разных классов Генная инженерия без клонирования – Полимеразная цепная реакция Кари Б. Муллис (Kary B. Mullis) – изобретатель полимеразной цепной реакции (ПЦР)Американский Полимеразная цепная реакция: 1-й цикл Полимеразная цепная реакция: 2-й цикл Изменение температуры в типичном трехступенчатом цикле ПЦР Полный температурный профиль полимеразной цепной реакции (25 циклов)a – начальная ПЦР как молекулярная копировальная машина («молекулярный ксерокс»)После 6 циклов ПЦР образуется 64 Количественная ПЦР ПЦР в реальном времени Real-time PCR Позволяет, не открывая Устройство капиллярного амплификатора LightCyclerКапилляры объемом 20 мкл обеспечивают высокое соотношение поверхности Принцип действия зондов TaqMan5’→3’-экзонуклеаза Taq-ДНК-полимеразы отщепляет флуоресцентный краситель, который начинает флуоресцировать в реакционной смеси ФлуорофорГаситель флуоресценции Принцип действия зондов – «молекулярных маяков» (molecular beacon probes)В растворе зонды образуют Праймеры, меченые флуорофорами, в ПЦР в реальном времениПраймеры «Амплифлюр»Праймеры «Скорпион» Мониторинг накопления продуктов ПЦР в реальном времени протекания реакцииСTСT – пороговый цикл Калибровочная кривая для определения количества ДНК-матрицы в пробеОпределение числа плазмидных копий гена Цифровая ПЦРПозволяет считать отдельные молекулы матричной ДНК в исследуемых образцах Новые системы секвенирования ДНК второго и третьего поколений Центр по секвенированию ДНК методом СэнгераОдна машина может анализировать 96 образцов одновременно Система секвенирования ДНК второго поколения123Фрагментация ДНКЛигирование адаптераПолучение полимеразных колоний фрагментов ДНКЦиклическое секвенирование Эмульсионная (эм)ПЦР на микрочастицах с иммобилизованным праймеромНачало 1-го цикла эмПЦРНачало 2-го цикла Секвенатор второго поколения фирмы Illumina Производительность – 600 Gb (6 x 1011 Цех секвенаторов 2-го поколения в КитаеФирма BGI-Shenzhen, ноябрь 2011 Секвенатор третьего поколения PacBio RS фирмы Pacific BiosciencesСистема коммерциализирована и активно продается в течение последнего года Схема синтеза ДНК в ZMW-волноводеВозбуждениеЭмиссияМеченые dNTPsВключившийся dNTPОдна молекула ДНК-полимеразы иммобилизована на дне Процесс секвенирования ДНК на SMRT-чипеВключающийся в ДНК меченый нуклеотид задерживается в объеме Секвенирование через нанопорыУникальная последовательность Профиль изменений силы электрического тока во времени при секвенировании через нанопорыВремя Секвенатор третьего поколения фирмы Oxford Nanopore Technologies (2014 г)Производительность 1 млрд «Новые направления в науке гораздо чаще создаются с помощью новых методов, а
Слайды презентации

Слайд 2 Что такое «генная инженерия»?
Раздел молекулярной генетики, занимающийся разработкой

Что такое «генная инженерия»?Раздел молекулярной генетики, занимающийся разработкой искусственных генетических систем

искусственных генетических систем с использованием манипуляций генами на молекулярном

уровне путем конструирования рекомбинантных ДНК и РНК



Слайд 3 «Новые направления в науке гораздо чаще создаются с

«Новые направления в науке гораздо чаще создаются с помощью новых методов,

помощью новых методов, а не новых концепций. Новые концепции

объясняют известные явления по-новому. Новые методы открывают новые явления, которые необходимо объяснить.» Freeman J. Dyson

Слайд 4 В. Гейзенберг: Профессионал это тот, кто знает основные ошибки

В. Гейзенберг: Профессионал это тот, кто знает основные ошибки в своей области и умеет их избегать

в своей области и умеет их избегать

Слайд 5 В классической генетике и селекции – отбор среди

В классической генетике и селекции – отбор среди потомства по определенным

потомства по определенным признакам ограничен репродуктивной изоляцией
В генной инженерии

при получении трансгенных организмов такие ограничения действуют слабее

Генная инженерия облегчает обмен генами между природными генетическими системами

Слайд 6 Программа-максимум генной инженерии – создание жизнеспособного организма de

Программа-максимум генной инженерии – создание жизнеспособного организма de novo по чертежам,

novo по чертежам, разработанным в лаборатории - «синтетическая биология»

2000

г. - геном вируса гепатита С (9,6 kbp)

Слайд 7 Крейг Вентер – один из лидеров современной синтетической

Крейг Вентер – один из лидеров современной синтетической биологииJohn Craig Venter,

биологии
John Craig Venter, born 1946
Разработал метод идентификации мРНК

с использованием EST-маркеров (expressed sequence tags)
1998 Основал фирму Selera (секвенирование генома человека)
2010 Синтетический митохондр. (16.3 kb) геном мыши
2010 Синтетический геном (580-kb ) и синтетический штамм Mycoplasma mycoides
2014 Синтетическая хромосома дрожжей III (273 kb) S. cerevisiae

Разработка и создание биологических модулей,
биологических систем и биологических машин
для решения прикладных задач

Слайд 8 Клонирование – одно из ключевых понятий генной инженерии

Клонирование – одно из ключевых понятий генной инженерии

Слайд 9 Что такое «клонирование»?
В генной инженерии: получение «клона»: препарата

Что такое «клонирование»?В генной инженерии: получение «клона»: препарата идентичных молекул ДНК

идентичных молекул ДНК
или
«идентичных» живых организмов

В случае ДНК

два пути решения задачи:
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Рекомбинантные молекулы ДНК

Слайд 10 Для чего нужны клоны ДНК?
Для удобства проведения исследований

Работать

Для чего нужны клоны ДНК?Для удобства проведения исследованийРаботать с индивидуальными молекулами ДНК трудно, но возможно

с индивидуальными молекулами ДНК трудно, но возможно

Слайд 11 Клонирование ДНК
Цель – получение клона идентичных последовательностей

1 –

Клонирование ДНКЦель – получение клона идентичных последовательностей1 – Объединение вектора со

Объединение вектора со вставкой чужеродной ДНК
2 – Введение рекомбинантного

вектора в клетки
3 – Размножение клеток
(получение клона клеток)

или амплификация молекул нуклеиновых кислот - ПЦР

Слайд 12 Выделение нуклеиновых кислот
Прежде чем клонировать последовательность, необходимо выделить

Выделение нуклеиновых кислотПрежде чем клонировать последовательность, необходимо выделить содержащую ее суммарную ДНК

содержащую ее суммарную ДНК

Слайд 13 Фенольный метод выделения ДНК
Нейтральные значения pH
Кислые значения pH
Водная

Фенольный метод выделения ДНКНейтральные значения pHКислые значения pHВодная фаза (ДНК и

фаза (ДНК и РНК)
Водная фаза (РНК)
Денатурированные белки
Фенольная фаза
Фенольная фаза

(ДНК)

Слайд 14 Взаимодействие ДНК с поверхностью стекла
Гуанидинизотиоцианат
Сорбция: кислые pH, высокая

Взаимодействие ДНК с поверхностью стеклаГуанидинизотиоцианатСорбция: кислые pH, высокая ионная силаЭлюирование: щелочные pH, низкая ионная сила

ионная сила
Элюирование: щелочные pH, низкая ионная сила

Слайд 15 Щелочной метод выделения бактериальных плазмид
pH 8,0

Фрагменты линейной ДНК

Щелочной метод выделения бактериальных плазмидpH 8,0Фрагменты линейной ДНК и кольцевая плазмидная

и кольцевая плазмидная ДНК
pH 12,0

Кольца плазмидной ДНК остаются зацепленными

друг за друга

pH 8,0

Линейная ДНК агрегирует, кольцевая восстанавливается

Слайд 16 Разделение нуклеиновых кислот
Цель: обогащение препаратов нуклеиновых кислот нужными

Разделение нуклеиновых кислотЦель: обогащение препаратов нуклеиновых кислот нужными последовательностями

последовательностями

Слайд 17 Аналитический электрофорез молекул ДНК в агарозном или полиакриламидном

Аналитический электрофорез молекул ДНК в агарозном или полиакриламидном геле

геле

Слайд 18 Калибровочная кривая для определения размеров фрагментов ДНК
kb =

Калибровочная кривая для определения размеров фрагментов ДНКkb = т.п.н. =тысячи пар нуклеотидов, mm10 kb1 kb

т.п.н. =
тысячи пар нуклеотидов
, mm
10 kb
1 kb

Слайд 19 Суперскрученная
Кольцевая ковалентно-
замкнутая
Релаксированная
Линейная
EcoRI
Формы плазмидной ДНК
Одно-
цепочечный
разрыв ДНК

СуперскрученнаяКольцевая ковалентно-замкнутаяРелаксированнаяЛинейнаяEcoRIФормы плазмидной ДНКОдно-цепочечный разрыв ДНК

Слайд 20 Электрофоретическая подвижность разных форм плазмиды в присутствии бромистого

Электрофоретическая подвижность разных форм плазмиды в присутствии бромистого этидияБромистый этидийРелаксЛинейнаяСупер.Увеличение отношения

этидия
Бромистый этидий
Релакс
Линейная
Супер.
Увеличение отношения EtBr/ДНК
Предел визуальной
чувствительности –
50 нг ДНК/полоса

Слайд 21 Ферменты, используемые в генной инженерии
Генные инженеры используют элементы

Ферменты, используемые в генной инженерииГенные инженеры используют элементы генетических систем, функционирующие в природе

генетических систем, функционирующие в природе

Слайд 22 Эндонуклеазы рестрикции класса II (рестриктазы) – основной инструмент

Эндонуклеазы рестрикции класса II (рестриктазы) – основной инструмент генной инженерииУзнают специфические

генной инженерии
Узнают специфические последовательности – сайты рестрикции
Активны в виде

димеров в присутствии ионов Mg2+
Изучено более 3000 и коммерчески доступно около 600 рестриктаз


Слайд 23 Номенклатура рестриктаз класса II
HaeI, HaeII, HaeIII – Haemophilus

Номенклатура рестриктаз класса IIHaeI, HaeII, HaeIII – Haemophilus aegipticus, открыты в

aegipticus, открыты в указанной последовательности
Hinc и Hind – Haemophilus

influenzae, штаммы c и d

Слайд 24 Субстратная специфичность рестриктаз класса II
Палиндромные сайты
мелкощепящие: BglI (GGCC),

Субстратная специфичность рестриктаз класса IIПалиндромные сайты мелкощепящие: BglI (GGCC), крупнощепящие: EcoRI (GAATTC),

крупнощепящие: EcoRI (GAATTC), NotI (GCGGCCGC)
Частично вырожденные сайты
HincII (GTYRAC,

Y = pYrimidine, R = puRine),
Разорванные сайты
BglI (GCCN5GGC, N = aNy)
Квазисимметричные сайты
BtrI (CAC↓GTC, класс IIQ)
Двойные сайты:
SfiI (GGCCN5 GGCC)
Разрезание со смещением - класс IIS
(FocI GGATGN9,13 Shifted cleavage) Последовательности липких концов уникальны
Изменение субстратной специфичности в неоптимальных условиях
EcoRI - GAATTC, EcoRI* - AATT (Mg2+ , органические растворители)

Слайд 25 Изомеры рестриктаз
Изошизомеры
Рестриктазы разных видов бактерий, узнающие одинаковые

Изомеры рестриктазИзошизомеры Рестриктазы разных видов бактерий, узнающие одинаковые сайты рестрикции и

сайты рестрикции и одинаково их расщепляющие.
Метилчувствительные рестриктазы:
HpaII и

MspI (CCGG) – первый не расщепляет ДНК, если хотя бы один из остатков C метилирован;
N-метилирование остатков A – Sau3A (и GATC и GMeATC), DpnI (только GMeATC), MboI (только GATC)
Гетерошизомеры
Узнают одинаковые сайты рестрикции, но по-разному их расщепляют (KpnI - G↓GTACC, Asp7181 - GGTAC↓C)
Изокаудомеры
Узнают разные сайты рестрикции, но создают одинаковые липкие концы. Лигирование с потерей сайта рестрикции
Not I GC*GGCC GC Bsp120 I G*GGCC C BamHI/BclI/BglII/BstYI/DpnII

Слайд 26 Формы разрывов ДНК, образующихся под действием рестриктаз класса

Формы разрывов ДНК, образующихся под действием рестриктаз класса II«Тупые» концы5’-выступающие3’-выступающие

II
«Тупые» концы
5’-выступающие
3’-выступающие

Слайд 27 Система бактериальной антивирусной защиты CRISPR/Cas CRISPR - Clustered

Система бактериальной антивирусной защиты CRISPR/Cas CRISPR - Clustered regularly interspaced short

regularly interspaced short palindromic repeats Cas - CRISPR associated proteins


Слайд 28 Два способа «затупления» липких концов ДНК
Заполнение ДНК-полимеразой
Удаление 3’->5’-экзонуклеазой
или

Два способа «затупления» липких концов ДНКЗаполнение ДНК-полимеразойУдаление 3’->5’-экзонуклеазойили S1-нуклеазой

S1-нуклеазой

Слайд 29 Механизм действия T4-ДНК-лигазы
Восстановление фосфодиэфирной связи между соседними остатками

Механизм действия T4-ДНК-лигазыВосстановление фосфодиэфирной связи между соседними остатками дезоксирибозы на месте

дезоксирибозы на месте одноцепочечного разрыва ДНК
Возможно лигирование фрагментов ДНК

по «тупым» концам

Слайд 30 Линкеры
Лигирование по
«тупым» концам



Расщепление
EcoRI





Лигирование по
«липким» концам,
клонирование
Создание новых

ЛинкерыЛигирование по«тупым» концамРасщепление EcoRIЛигирование по «липким» концам,клонированиеСоздание новых сайтов рестрикции на концах клонируемых молекул ДНК

сайтов рестрикции на концах клонируемых молекул ДНК

Слайд 31 Адаптеры
Создание новых сайтов рестрикции на концах клонируемых молекул

АдаптерыСоздание новых сайтов рестрикции на концах клонируемых молекул ДНКбез использования рестриктазЛигирование

ДНК
без использования рестриктаз
Лигирование по
«тупым» концам
(димеризации
адаптеров
не происходит из-за
отсутствия

5’-фосфат-
ной группы)

Фосфорилирование
концов вставки




Лигирование по
«липким» концам,
клонирование

Слайд 32 Щелочная фосфатаза и полинуклеотидкиназа
Щелочная фосфатаза:
Оптимальные значения pH -

Щелочная фосфатаза и полинуклеотидкиназаЩелочная фосфатаза:Оптимальные значения pH - щелочныеУдаление 5’-фосфатных групп

щелочные
Удаление 5’-фосфатных групп (дефосфорилирование) из ДНК, РНК и нуклеотидов
Фосфатаза

кишечника телят (calf intestinal phosphatase - CIP). Термолабильна
Полинуклеотидкиназа бактериофага T4:
Перенос γ-фосфатной группы ATP на 5’-OH-группу фрагментов ДНК (фосфорилирование). Введение радиоактивной метки, подготовка к лигированию

Слайд 33 ДНК-зависимые ДНК-полимеразы
ДНК-полимераза I (Pol I) (EC 2.7.7.7)
Мол. масса

ДНК-зависимые ДНК-полимеразыДНК-полимераза I (Pol I) (EC 2.7.7.7) Мол. масса 109 кДа, Активности:

109 кДа, Активности: 5’->3’-полимераза, 5’->3’- и 3’->5’- (корректирующая) –экзонуклеазы.

Введение концевой метки в ДНК, ник-трансляция, синтез 2-й цепи кДНК.
Фрагмент Кленова: мол. масса 76 кДа (субтилизин), отсутствует 5’->3’-экзонуклеазная активность, введение метки, одноцепочечные зонды.
Термостабильные ДНК-полимеразы
T4-ДНК-полимераза
Мол. масса 114 кДа, отсутствует 5’->3’-экзонуклеаза, введение метки, «шлифовка» концов ДНК 3’->5’- экзонуклеазой.
T7-ДНК-полимераза
«Секвеназа» - искусственно снижена 3’->5’- экзонуклеазная активность, повышены процессивность и скорость синтеза ДНК. «Термосеквеназа» - получена из Taq-ДНК-полимеразы – повышено сродство к ddNTPs, снижена активность 5’->3’-экзо

Слайд 34 Обратные транскриптазы (ОТ)
ОТ вируса миелобластоза птиц (AMV RT)

Обратные транскриптазы (ОТ)ОТ вируса миелобластоза птиц (AMV RT) – димер, хорошо

– димер, хорошо транскрибирует сильно структурированные матрицы

ОТ вируса мышиного

лейкоза Молони (M-MLV RT) – мономер, рекомбинантный фермент

OT ВИЧ-1 – транскрибирует как РНК, так и ДНК

Нуждаются в ДНК-затравке (праймере)
Обладают активностью РНКазы H, деградирует РНК-матрицу в процессе синтеза первой цепи
Мутанты рекомбинантной M-MLV RT без РНКазы H более эффективны в синтезе первой цепи кДНК
Высокая частота ошибок – до 5 х 10–3/нуклеотид

Слайд 35 Три стратегии синтеза первой цепи кДНК обратной транскриптазой
Случайный

Три стратегии синтеза первой цепи кДНК обратной транскриптазойСлучайный праймерОлиго(dT)-праймерСпецифический праймер

праймер
Олиго(dT)-праймер
Специфический праймер

Слайд 36 SMART-синтез кДНК
Олиго-dC присоединяется независимо от матрицы обратной транскриптазой
Олиго-dG

SMART-синтез кДНКОлиго-dC присоединяется независимо от матрицы обратной транскриптазойОлиго-dG с адаптером исходно

с адаптером исходно добавлен в реакционную смесь и используется

ОТ в качестве матрицы для завершения синтеза первой цепи кДНК

Слайд 37 Векторы

Молекулярно-генетические конструкции, предназначенные для переноса генетического материала в

Векторы Молекулярно-генетические конструкции, предназначенные для переноса генетического материала в клетки живых организмовВекторы

клетки живых организмов

Векторы для клонирования (Cloning vectors)
Экспрессирующие векторы (Expression

vectors)
Векторы для слияния генов (Gene fusion vectors)
Бинарные (челночные) векторы (Shuttle vectors)

Слайд 38 Свойства, которыми должен обладать любой вектор
Способность к длительному

Свойства, которыми должен обладать любой векторСпособность к длительному существованию в клетках-хозяевах

существованию в клетках-хозяевах (репликация автономная или в составе хромосом)
Наличие

биохимических или генетических маркеров, которые позволяют обнаруживать его присутствие в клетках
Должны допускать встраивание чужеродной ДНК без нарушения своей функциональной целостности

Слайд 39 Плазмидные векторы

Плазмидные векторы

Слайд 40 Плазмидный вектор pUC18
bla – Ген β-лактамазы, селектируемый маркер

Плазмидный вектор pUC18bla – Ген β-лактамазы, селектируемый маркер (устойчивость ампициллину)ori –

(устойчивость ампициллину)
ori – Точка начала репликации (origin)
lacZ ‘ –

N-концевая часть гена β-галактозидазы (кодирует146 из 1021 АК- остатков), селектируемый маркер (хромогенный субстрат X-Gal)
lacI – Ген Lac-репрессора (Индуктор – IPTG)

Полилинкер

Слайд 41 Плазмидный вектор Bluescript
Promega
Фагмида (Phagemid)
Заражение бактериальных клеток, содержащих фагмиды,

Плазмидный вектор BluescriptPromegaФагмида (Phagemid)Заражение бактериальных клеток, содержащих фагмиды, фагом-помощником, приводит к

фагом-помощником, приводит к синтезу одноцепочечной ДНК фагмиды и ее

упаковке в фаговые частицы

Слайд 42 TA-Клонирование продуктов ПЦР
Taq-ДНК-полимераза образует в продукте ПЦР 3’-выступающие

TA-Клонирование продуктов ПЦРTaq-ДНК-полимераза образует в продукте ПЦР 3’-выступающие A-концы независимо от матрицы

A-концы независимо от матрицы

Слайд 43 Структура бактериального гена и его некоторых сильных промоторов
terminator
Регуляторная

Структура бактериального гена и его некоторых сильных промоторовterminatorРегуляторная часть генаСтруктурная часть гена

часть гена
Структурная часть гена

Слайд 44 Регуляция экспрессии генов в векторе pET
Бактериальная
клетка BL21DE
Novagene

Регуляция экспрессии генов в векторе pETБактериальнаяклетка BL21DENovagene

Слайд 45 Искусственные хромосомы

Искусственные хромосомы

Слайд 46 Искусственная хромосома дрожжей YAC (Yeast Artificial Chromosome)
>2000 т.п.н.
ura3 –

Искусственная хромосома дрожжей YAC (Yeast Artificial Chromosome)>2000 т.п.н.ura3 – ген оротидин-5’-фосфатдекарбоксилазыжизненноважный:

ген оротидин-
5’-фосфатдекарбоксилазы
жизненноважный:
позитивный отбор
5-фтороротовая кислота (нетоксична)
5-фторурацил (токсичен)
негативный отбор
5-ФОК

Слайд 47 Бактериальная искусственная хромосома (BAC)
Cmr
oriS
repE
parA
parB
parA, parB – контроль числа

Бактериальная искусственная хромосома (BAC)CmroriSrepEparAparBparA, parB – контроль числа копий (1-2)Cmr –

копий (1-2)

Cmr – селектируемый маркер

oriS, repE – односторонняя

репликация

cosN – сайт терминазы λ

loxP – cre-рекомбиназа фага P1

cosN

loxP

Емкость – 300 т.п.н.
Стабилен на протяжении 100 генераций

Слайд 48 Емкости векторов разных классов

Емкости векторов разных классов

Слайд 49
Генная инженерия без клонирования
–
Полимеразная цепная реакция

Генная инженерия без клонирования – Полимеразная цепная реакция

Слайд 50 Кари Б. Муллис (Kary B. Mullis) – изобретатель

Кари Б. Муллис (Kary B. Mullis) – изобретатель полимеразной цепной реакции

полимеразной цепной реакции (ПЦР)
Американский биохимик 1944 г.р.
Патент - 1985

г., фирма Cetus Corp. California
Нобелевская премия по химии – 1993 г.

Слайд 51

Слайд 52

Слайд 53

Слайд 54

Слайд 55 Полимеразная цепная реакция: 1-й цикл

Полимеразная цепная реакция: 1-й цикл

Слайд 56 Полимеразная цепная реакция: 2-й цикл

Полимеразная цепная реакция: 2-й цикл

Слайд 57 Изменение температуры в типичном трехступенчатом цикле ПЦР

Изменение температуры в типичном трехступенчатом цикле ПЦР

Слайд 58 Полный температурный профиль полимеразной цепной реакции (25 циклов)
a

Полный температурный профиль полимеразной цепной реакции (25 циклов)a – начальная

– начальная
денатурация
ДНК

b

– собственно
реакция

с – достройка
цепей ДНК

d – хранение 4°С

Слайд 59 ПЦР как молекулярная копировальная машина («молекулярный ксерокс»)
После 6

ПЦР как молекулярная копировальная машина («молекулярный ксерокс»)После 6 циклов ПЦР образуется

циклов ПЦР образуется 64 идентичных копии исходного генетического локуса

(ампликона)
Ни одна реакция в цикле не доходит до конца

Слайд 60 Количественная ПЦР ПЦР в реальном времени Real-time PCR Позволяет, не открывая

Количественная ПЦР ПЦР в реальном времени Real-time PCR Позволяет, не открывая

пробирки, непрерывно следить за накоплением продуктов ПЦР в пробах

Слайд 61 Устройство капиллярного амплификатора LightCycler
Капилляры объемом 20 мкл обеспечивают

Устройство капиллярного амплификатора LightCyclerКапилляры объемом 20 мкл обеспечивают высокое соотношение поверхности

высокое соотношение поверхности к объему и высокую скорость теплообмена.

30 циклов завершаются за 20-30 мин

Слайд 62 Принцип действия зондов TaqMan
5’→3’-экзонуклеаза Taq-ДНК-полимеразы отщепляет флуоресцентный краситель,

Принцип действия зондов TaqMan5’→3’-экзонуклеаза Taq-ДНК-полимеразы отщепляет флуоресцентный краситель, который начинает флуоресцировать в реакционной смеси ФлуорофорГаситель флуоресценции

который начинает флуоресцировать в реакционной смеси
Флуорофор
Гаситель флуоресценции

Слайд 63 Принцип действия зондов – «молекулярных маяков» (molecular beacon

Принцип действия зондов – «молекулярных маяков» (molecular beacon probes)В растворе зонды

probes)
В растворе зонды образуют структуру «стебель-петля», что приводит к

сближению флуорофора и гасителя флуоресценции

Слайд 64 Праймеры, меченые флуорофорами, в ПЦР в реальном времени
Праймеры

Праймеры, меченые флуорофорами, в ПЦР в реальном времениПраймеры «Амплифлюр»Праймеры «Скорпион»

«Амплифлюр»
Праймеры «Скорпион»

Слайд 65 Мониторинг накопления продуктов ПЦР в реальном времени протекания

Мониторинг накопления продуктов ПЦР в реальном времени протекания реакцииСTСT – пороговый цикл

реакции
СT
СT – пороговый цикл

Слайд 66 Калибровочная кривая для определения количества ДНК-матрицы в пробе
Определение

Калибровочная кривая для определения количества ДНК-матрицы в пробеОпределение числа плазмидных копий

числа плазмидных копий гена F8 в трансфицированных клетках человека
Концентрация

ДНК в крайних точках различается на 9 порядков

Слайд 67 Цифровая ПЦР
Позволяет считать отдельные молекулы матричной ДНК в

Цифровая ПЦРПозволяет считать отдельные молекулы матричной ДНК в исследуемых образцах

исследуемых образцах

Слайд 68 Новые системы секвенирования ДНК второго и третьего поколений

Новые системы секвенирования ДНК второго и третьего поколений

Слайд 69 Центр по секвенированию ДНК методом Сэнгера
Одна машина может

Центр по секвенированию ДНК методом СэнгераОдна машина может анализировать 96 образцов

анализировать 96 образцов одновременно (96 капилляров),
750 п.н. за один

прогон, 6 прогонов в день,
Итого:
одна машина может определять
~345 600 п.н. в один день

Слайд 70 Система секвенирования ДНК второго поколения
1
2
3
Фрагментация ДНК
Лигирование адаптера
Получение полимеразных

Система секвенирования ДНК второго поколения123Фрагментация ДНКЛигирование адаптераПолучение полимеразных колоний фрагментов ДНКЦиклическое

колоний фрагментов ДНК
Циклическое секвенирование микроматрицы
Одновременно секвенируются миллионы молекул ДНК
За

один прогон прибора секвенируются более 1 миллиарда нуклеотидов ДНК – 1000-кратное увеличение производительности

Слайд 71 Эмульсионная (эм)ПЦР на микрочастицах с иммобилизованным праймером
Начало 1-го

Эмульсионная (эм)ПЦР на микрочастицах с иммобилизованным праймеромНачало 1-го цикла эмПЦРНачало 2-го

цикла эмПЦР
Начало 2-го цикла эмПЦР
Начало 3-го цикла эмПЦР
эмПЦР
Матрица оцДНК
Праймеры
Гидрофобная

фаза

эмПЦР

Слайд 72 Секвенатор второго поколения фирмы Illumina
Производительность – 600

Секвенатор второго поколения фирмы Illumina Производительность – 600 Gb (6 x

Gb (6 x 1011 bp) за 11 дней;
Макс.

длина секвенируемого фрагмента – 2 x 100 bp;
Секвенирование синтезом, молек. колонии - кластеры на стекле

Слайд 73 Цех секвенаторов 2-го поколения в Китае
Фирма BGI-Shenzhen, ноябрь

Цех секвенаторов 2-го поколения в КитаеФирма BGI-Shenzhen, ноябрь 2011

2011

Слайд 74 Секвенатор третьего поколения PacBio RS фирмы Pacific Biosciences
Система

Секвенатор третьего поколения PacBio RS фирмы Pacific BiosciencesСистема коммерциализирована и активно продается в течение последнего года

коммерциализирована и активно продается в течение последнего года

Слайд 75 Схема синтеза ДНК в ZMW-волноводе
Возбуждение
Эмиссия
Меченые dNTPs
Включившийся dNTP
Одна молекула

Схема синтеза ДНК в ZMW-волноводеВозбуждениеЭмиссияМеченые dNTPsВключившийся dNTPОдна молекула ДНК-полимеразы иммобилизована на

ДНК-полимеразы иммобилизована на дне каждого волновода
Флуорофор присоединен к γ-фосфатной

группе нуклеотида-субстрата

Слайд 76 Процесс секвенирования ДНК на SMRT-чипе
Включающийся в ДНК меченый

Процесс секвенирования ДНК на SMRT-чипеВключающийся в ДНК меченый нуклеотид задерживается в

нуклеотид задерживается в объеме считывания флуоресценции в течение миллисекунд,

свободно диффундирующий нуклеотид – в течение наносекунд.

Включение обнаруживается в виде вспышки света определенной длины волны, характерной для конкретного нуклеотида..

Слайд 77 Секвенирование через нанопоры
Уникальная последовательность

Секвенирование через нанопорыУникальная последовательность ГомополимерЧасть мембраны с

Гомополимер
Часть мембраны с нанопорой,

через которую проходит одноцепочечная ДНК

Изменения силы тока, проходящего через мембрану, под действием отдельных нуклеотидов ДНК

Слайд 78 Профиль изменений силы электрического тока во времени при

Профиль изменений силы электрического тока во времени при секвенировании через нанопорыВремя

секвенировании через нанопоры
Время

Слайд 79 Секвенатор третьего поколения фирмы Oxford Nanopore Technologies (2014

Секвенатор третьего поколения фирмы Oxford Nanopore Technologies (2014 г)Производительность 1 млрд

г)
Производительность 1 млрд нуклеотидов за 6 часов. Ср. длина

считывания: 5,4 kb.
Десятки тысяч нуклеотидов/1 прогон
Компьютер – ноутбук с USB-разъемом
Стоимость ~$900

Дэвид Димер (David Deamer) -
Предложил принцип метода секвенирования через нанопоры в 1989 году
2014 – секвенирован бактериальный геном

A good first shot, but not a game-changer — yet!

  • Имя файла: osnovy-biotehnologii-i-biomeditsiny.pptx
  • Количество просмотров: 136
  • Количество скачиваний: 0
- Предыдущая Основы электротехники и радиоэлектроники
Следующая - Языковая личность

Похожие презентации

Методические рекомендации для родителей по автоматизации звуков [р] и [рь] у детей на материале лексической темы Насекомые. методическая разработка (средняя, старшая, подготовительная группа) по теме Методические рекомендации для родителей по автоматизации звуков [р] и [рь] у детей на материале лексической темы Насекомые. методическая разработка (средняя, старшая, подготовительная группа) по теме 130
Сообщество лесопарк Тропарёво Сообщество лесопарк Тропарёво 123
iz istorii chasov iz istorii chasov 103
Марксизм Марксизм 89
Духовно-нравственное воспитание через урочную и внеурочную деятельность презентация к уроку Духовно-нравственное воспитание через урочную и внеурочную деятельность презентация к уроку 117
презентация Приемная в дошкольном учреждении презентация презентация Приемная в дошкольном учреждении презентация 51
Консультация для родителей Возрастные особенности развития ребенка от 5 до 6 лет консультация (старшая группа) по теме Консультация для родителей Возрастные особенности развития ребенка от 5 до 6 лет консультация (старшая группа) по теме 177
Згубна дія алкоголю на організм людини Згубна дія алкоголю на організм людини 97
Учебно-методическое пособие Дидактическая игра Собери Шарики для детей 6-7 лет учебно-методическое пособие (подготовительная группа) Учебно-методическое пособие Дидактическая игра Собери Шарики для детей 6-7 лет учебно-методическое пособие (подготовительная группа) 142
Адаптация детей к дошкольным группам презентация к уроку (младшая группа) Адаптация детей к дошкольным группам презентация к уроку (младшая группа) 112
Практико-ориентированный проект Здоровье! Будь с нами! презентация к уроку по теме Практико-ориентированный проект Здоровье! Будь с нами! презентация к уроку по теме 129
tehnologiya sotrudnichestva tehnologiya sotrudnichestva 105
Презентация Исследование космоса, Природоведение, 5 класс Презентация Исследование космоса, Природоведение, 5 класс 210
Теории валютного курса Теории валютного курса 193
Краткосрочный Проект Космос презентация к уроку (подготовительная группа) Краткосрочный Проект Космос презентация к уроку (подготовительная группа) 85
Проектно-исследовательская деятельность учащихся глазами эксперта презентация к уроку Проектно-исследовательская деятельность учащихся глазами эксперта презентация к уроку 145
Орифлэймсоздал эксклюзивную коллекцию королевских украшений royal! Изысканная простота и элегантность, благородство натуральных драгоценных камней в изящном ювелирном обрамлении. Произведения искусства из коллекции royal помогут тебе создать притягательны Орифлэймсоздал эксклюзивную коллекцию королевских украшений royal! Изысканная простота и элегантность, благородство натуральных драгоценных камней в изящном ювелирном обрамлении. Произведения искусства из коллекции royal помогут тебе создать притягательны 156
презентация Предметно-развивающая среда в группе детского сада презентация презентация Предметно-развивающая среда в группе детского сада презентация 137
Адаптация первокласников к школе статья Адаптация первокласников к школе статья 105
Тема 1: Введение в Менеджмент Тема 1: Введение в Менеджмент 103
Презентация Формирование семейных ценностей презентация Презентация Формирование семейных ценностей презентация 108
Техника изготовления тряпичных кукол. презентация по конструированию, ручному труду Техника изготовления тряпичных кукол. презентация по конструированию, ручному труду 103
Презентация Поговори со мною, мама! презентация по теме Презентация Поговори со мною, мама! презентация по теме 53
Русский этнос в Казахстане. Русский этнос в Казахстане. 115
Добыча и подготовка угля к доменной плавке Добыча и подготовка угля к доменной плавке 96
Методы и приёмы, формирующие познавательную активность учащихся презентация к уроку Методы и приёмы, формирующие познавательную активность учащихся презентация к уроку 95
Презентация Коллаж. Здравствуй, детский сад. презентация к уроку (средняя группа) Презентация Коллаж. Здравствуй, детский сад. презентация к уроку (средняя группа) 119
Высший позор – ради жизни утратить смысл жизни (Ювенал).(По сказке М.Е. Салтыкова-Щедрина Премудрый пескарь) Высший позор – ради жизни утратить смысл жизни (Ювенал).(По сказке М.Е. Салтыкова-Щедрина Премудрый пескарь) 112
kartoteka kartoteka 142
Деятельность по обобщению и распространению собственного педагогического опыта и мастерства материал Деятельность по обобщению и распространению собственного педагогического опыта и мастерства материал 127