Презентация на тему Возбудители коклюша, дифтерии и туберкулеза. Методы их микробиологической диагностики. (Тема 5)

был обнаружен впервые в 1883 г. Э. Клебсом в

срезах из пленки, полученнойфтч из ротовой полости больных людей; выделен в чистой культуре в 1884 г. Ф. Леффлером.
В 1888 г. Э. Ру и А. Иерсен обнаружили его способность продуцировать экзотоксин, играющий главную роль в этиологии и патогенезе дифтерии.
Получение в 1892 г. антитоксической сыворотки Э. Берингом и использование ее с 1894 г. для лечения дифтерии позволило значительно снизить летальность. Успешное наступление на эту болезнь началось после 1923 г. в связи с разработкой Г. Рамоном метода получения дифтерийного анатоксина.

(coryne – булава, bacterium – палочка)
• Вид –

C. diphtheriae (пленка, перепонка), дифтероиды:
C. pseudodiphthericum (палочка Хофманна),
С. xerosis ,
C. ulcerans.

изогнутые палочки. Располагаются под углом друг к другу в

виде английских букв V, реже Х.
Не образуют спор, не имеют жгутиков, у многих штаммов выявляют микрокапсулу.
Характерная особенность - наличие на концах палочки зерен волютина (обусловливает булавовидную форму). По Нейссеру: цитоплазма желтого цвета, зерна волютина – синего.
По Граму окрашивается положительно.

окраске по Леффлеру и Нейссеру

окраска по Граму

(границы роста 15-40 °С), оптимальная рН 7,6-7,8.
Растет на специальных

питательных средах с кровью и сывороткой (кровяной теллуритовый агар), на которой дифтерийная палочка по способности продуцировать гемолизин даёт колонии 3 типов:
а) биовар gravis;. б) биовара mitis; в) биовар intermedius.

декстрин;
• Восстанавливает нитраты;
•На средах с теллуритом – крупные

сухие матовые плоские серо-черные колонии, приподнятые в центре, с радиальной исчерченностью и неровным краем (напоминают маргаритку);
• На жидкой среде – пленка, помутнение и крупнозернистый осадок;
• На кровяных средах – гемолиза ±;
•Обладает выраженными токсигенными свойствами;
•Выделяется от больных с тяжелой формой дифтерии, вызывает групповые вспышки.

Колонии Corynebacterium diphteriae: на рисунках слева — в натуральную величину, справа-колонии, увеличенные в 10 раз — биотип гравис на кровяном теллуритовом агаре (72-часовая культура).

крахмал, гликоген и декстрин;
• Восстанавливает нитраты;
•На средах

с теллуритом – мелкие гладкие блестящие полупрозрачные черные колонии с ровным краем;
•На жидкой среде – равномерное помутнение и порошкообразный осадок;
• На кровяных средах – зоны гемолиза;
• Малотоксичен;
•Вызывает легкую спорадическую заболеваемость.

Колонии Corynebacterium diphteriae: на рисунке слева — в натуральную величину, справа-колонии, увеличенные в 10 раз — биотип митис на кровяном теллуритовом агаре (72-часовая культура)

сходен с биоваром gravis;
• на средах с теллуритом

– мелкие сухие матовые серо-черные колонии с неровным краем;
• на жидкой среде – помутнение с последующим образованием мелко-зернистого осадка;
• гемолиз на кровяных средах отсутствует.

эпителиоцитам миндалин, реже гортани, трахеи, полости носа, конъюнктивы глаза,

вульвы;
колонизация эпителиоцитов сопровождается развитием воспалительного процесса;
гиалуронидаза, фибринолизин, нейраминидаза, гемолизин – факторы инвазии;
микрокапсула – антифагоцитарный фактор;
корд-фактор – нарушает дыхание в митохондриях и обладает антфагоцитарной активностью;
дифтерийный гистотоксин – экзотоксин, главный фактор патогенности, обладает дермонекротическими и гемолитическими свойствами (синтезируют только C. diphtheriae, лизогенные tox -профагом).

Полоску стерильной фильтровальной бумаги смачивают антитоксической противодифтерийной сывороткой и

наносят на поверхность плотной питательной среды в чашке Петри. Чашку подсушивают в термостате 15-20 минут. Испытуемые культуры засевают бляшками по обе стороны от полоски фильтровальной бумаги. Чашки с посевами инкубируют при 37°С, результаты учитывают через 24-48 часов. Результатом взаимодействия токсина и антитоксина (антитоксических антител) является образование в геле четкой линии преципитации.
Биологические пробы на животных. Внутрикожное заражение морских свинок фильтратом бульонной культуры дифтерийных бактерий вызывает у них некроз в месте введения. Наиболее характерным проявлением действия токсина является поражение надпочечников.
Заражение куриных эмбрионов - дифтерийный токсин вызывает их гибель.
Заражение культур клеток - дифтерийный токсин вызывает отчетливый цитопатический эффект.
Метод твердофазного иммуноферментного анализа с использованием меченных пероксидазой антитоксинов.
Использование ДНК-зонда для непосредственного обнаружения tox-оперона в хромосоме дифтерийных бактерий.

проявляется глубокой интоксикацией организма дифтерийным токсином и характерным фибринозным

воспалением в месте локализации возбудителя. Название болезни происходит от греческого слова diphtheria — кожа, пленка, так как в месте размножения возбудителя образуется плотная, серовато-белого цвета пленка.

Механизмы и пути передачи инфекции:
1. Аэрогенный (пути – воздушно-капельный

и воздушно-пылевой);
2. Контактный (путь – непрямой контактный);
3. Фекально-оральный (путь – алиментарный).
Входные ворота: слизистые оболочки носа, зева, гортани, трахеи, бронхов, конъюктивы, наружных половых органов, раневая поверхность. Инкубационный период – 2 -10 дней.

ротоглотки

носа, пленки с миндалин, раневое отделяемое, кровь.
Бактериоскопический

метод.
2. Бактериологический метод (основной).
Определение токсигенности C. diphtheriae:
- биологическая проба на животных – внутрикожное введение морским свинкам культуры дифтерийной палочки – некроз в месте введения, последующая гибель животного;
- заражение куриных эмбрионов (гибель);
внесение в культуру клеток (ЦПД);
ИФА;
- ДНК-зонды для обнаружения tox -оперона в геноме;
- РП в агаре.
3. Серодиагностика – РПГА, ИФА, РИА, реакция ко-агглютинации, проба Шика.
4. Экспресс-диагностика – РИФ, ИФА, РПГА, реакция ко-агглютинации.
5. Молекулярно-биологический метод – ПЦР (обнаружение tox -гена).

дифтерийный анатоксин (дифтерийный гистотоксин, утративший токсичность, но сохранивший антигенные

свойства в результате обработки формалином при 37-40°С в течение 3 недель:
АД – адсорбированный дифтерийный анатоксин
АДС – адсорбированный дифтерийно-столбнячный анатоксин
АДС-М анатоксин -вакцина для профилактики дифтерии и столбняка с уменьшенным содержанием антигенов
АД-М анатоксин вакцина для профилактики дифтерии с
уменьшенным содержанием антигенов
Имовакс Д.Т. Адюльт вакцина для профилактики дифтерии и столбняка, аналог АДС-М (Aventis Pasteur, Франция)
ДТ Вакс вакцина для профилактики дифтерии и столбняка, аналог АДС

Специфическая профилактика

гемофильной инфекции типа b (Франция)
Тританрикс вакцина для профилактики коклюша,

дифтерии, столбняка и гепатита В ( СмитКляйн Бичем, Бельгия)
Тетракок 05 вакцина для профилактики коклюша, дифтерии, столбняка и полиомиелита (Aventis Pasteur, Франция) Инфанрикс бесклеточная вакцина для профилактики коклюша, дифтерии и столбняка (Бельгия)
Пентаксим Вакцина для профилактики дифтерии и столбняка адсорбированная, коклюша ацеллюлярная, полиомиелита инактивированная, инфекции, вызываемой Haemophilus influenzae тип b конъюгированная.
АКДС – адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина

можно раньше, пока токсин не связался с тканью миокарда

и нервной системы),
антибиотики (β-лактамные, тетрациклины, хинолоны; носителей санируют эритромицином).
Выписка из стационара возможна после двукратного отрицательного бактериологического исследования.

обнаружен в 1900 г. в мазках из мокроты ребенка

и затем выделен в чистой культуре в 1906 г. Ж. Борде и О. Жангу. Впоследствии возбудитель получил название палочка Борде-Жангу.

Возбудители коклюша и паракоклюша относятся к отделу Gracilicutes,
семейству Alcaligenaceae,
роду Bordetella,
вид Bordetella pertussis (палочка Борде-Жангу, возбудитель коклюша) и
вид Bordetella parapertussis
(возбудитель паракоклюша).

розовый или красный цвет. Бордетелла неподвижна, по размеру напоминает

короткую палочку коковидной формы, концы закруглены, длина составляет 0,5 — 2 мкм, не образуют спор, в мазках располагаются отдельно, реже — попарно, образуют капсулу, обеспечивающую защиту микроба от фагоцитоза.
Паракоклюшная палочка более крупная.

37°С. B.pertussis очень медленно растет только на специальных питательных

средах, например, на среде Борде — Жангу (картофельно-глицериновый агар с добавлением крови), образуя колонии, похожие на капельки ртути. Характерна S-R-трансформация. Расщепляют глюкозу и лактозу до кислоты без газа. Бордетеллы являются аэробами, культивируются на специальных питательных средах: картофельно-глицериновом агаре с 20—25% крови человека (среда Борде—Жангу) и казеиново-угольном агаре (КУА).

Для подавления роста сопутствующей флоры к средам добавляется пенициллин. Коклюшные и паракоклюшные бактерии на среде Борде—Жангу образуют мелкие блестящие выпуклые колонии, напоминающие капельки ртути и серовато-кремового цвета колонии на КУА. Оба вида бактерий обладают гемолити-ческими свойствами.

капсульными К-антигенами (К-АГ), которые принято называть факторами.
Фактор 7

является общим для всех бордетелл - родоспецифический АГ.
Фактор 1 - видоспецифический АГ B. pertussis,
фактор 14 - видоспецифический АГ для B. parapertussis,
фактор 12 является основным у B. bronchiseptica. Их выявляют в реакции агглютинации с монорецепторными сыворотками.

Бактерии рода Bordetella также имеют соматический термостабильный родоспецифический О-антиген, обнаруживаемый у вирулентных S-форм бордетелл всех видов.

термостабильный белок, состоящий из 2-х субъединиц А и В,

стимулирует лимфоцитоз, оказывает нейротоксическое действие

Филаментозный гемагглютинин является одним из компонентов наружной оболочки бактериальной клетки. Способствует прикреплению микроорганизмов к эпителиальным клеткам дыхательных путей.

Аденилатциклаза – полипептид, который повышает концентрацию цАМФ в различных клетках, включая макрофаги и нейтрофилы, что подавляет их активность. Также обладает гемагглютинирующим действием.

структурный элемент пептидогликана клеточной стенки. Активирует макрофаги с выделением

провоспалительных цитокинов. Воспаление приводит к повреждению эпителиального слоя. Обладает таким свойством, как пирогенность.

Гистамин-сенсибилизирующий фактор повышает восприимчивость тканей к повреждающему действию гистамина.

Пертактин и волокнистый гемагглютинин способствуют слипанию бактерий с мерцательным эпителием дыхательных путей.

Микроворсинки способствуют слипанию бактерий с мерцательным эпителием дыхательных путей.

Источник инфекции при коклюше и паракоклюше –больной человек типичной

или стертой формой, особенно в период до появления спазматического кашля или бактерионоситель.
Путь передачи возбудителя - воздушно-капельный. Бордетеллы обладают специфическим тропизмом к реснитчатому эпителию респираторного тракта хозяина. К инфекции восприимчивы люди всех возрастов, но более всего дети от 1 года до 10 лет.
Наиболее тяжело коклюш протекает у детей первого года жизни.

Бордетеллы не проникают внутрь клетки (неинвазивные микробы) и не

поступают в кровь.
Первая стадия – адгезия возбудителя на поверхности клеток.
Вторая стадия – местное повреждение тканей токсинами микроба. Возбудитель размножается на поверхности клеток эпителия, обусловливая развитие воспалительных катаральных явлений и возникновение очагов некроза. В более низкие отделы (мелкие бронхи, бронхиолы, альвеолы) возбудитель распространяется бронхогенным путем. Бактериемии при коклюше не бывает.
Третья стадия – стадия системных проявлений. Следствием некротических поражений является постоянное раздражение рецепторов афферентных волокон блуждающего нерва; возбуждение передается в область кашлевого центра, где формируется стационарный очаг возбуждения. В результате развивается основной симптомокомплекс коклюша – приступы судорожного кашля.

the bacteria
which causes "whooping cough» -
«кричащий кашель»

-
КОКЛЮШ

Коклюшный токсин блокирует связанные с β2-рецепторами бронхов G-белки, мешая работать симпатической нервной системе и вызывая спазм (за счет усиления парасимпатических влияний).

КОКЛЮШ

состояние
слабый, но упорный кашель
Пароксизмальная стадия (2 – 4 недели):
спастический

кашель
частая рвота
угнетение сознания
Стадия выздоровления (4 – 6 недель):
постепенное исчезновение симптомов коклюша
В настоящее время преобладают (95%) умеренно выраженные и стертые формы заболевания

чистой культуры в качестве материала используют слизь с задней

стенки глотки, которую высевают на КУА или среду Борде-Жангу. Материал берут с помощью клювовидного (через рот) или прямого (через нос) тампона с задней стенки глотки. Посев также может быть сделан методом “кашлевых пластинок” (во время кашля ко рту больного на расстоянии 8-10 см подносят открытую чашку с питательной средой). Выросшую культуру идентифицируют по культуральным, биохимическим и антигенным свойствам.
В качестве ускоренного применяют иммунофлуоресцентный метод – РИФ с материалом из зева больного и флюоресцентной сывороткой (позволяет получить ответ через 4-5 часов после взятия материала).
Серологические методы (реакция агглютинации, непрямой гемагглютинации, связывания комплемента) используют как вспомогательные при выявлении атипичных форм, а также для ретроспективной диагностики, поскольку антитела к возбудителю появляются не ранее третьей недели заболевания.

используют адсорбированную коклюшно-дифтерийно-столбнячную вакцину (АКДС), где коклюшный компонент представлен

убитыми коклюшными бактериями.
Для лечения применяют антибиотики (гентамицин, ампициллин, эритромицин, тетрациклин), которые эффективны в катаральном периоде и не эффективны в судорожном периоде заболевания.

phthisis – истощение, чахотка, увядание). Анг. врач Мортон автор

первой монографии «Фтизиология или трактат о чахотке» (1689 г).

“Современная клиническая бактериология начинается с открытия туберкулезной бациллы (1882 г) Р.Кохом” (Габричевский Г.Н.).

Возбудители туберкулеза:
М. tuberculosis (бацилла Коха)
M. аfricanum
M. bovis
M. avium

Р. Кох (1843—1910) –
лауреат Нобелевской премии

С глубокой древности это заболевание было известно под названиями чахотка, бугорчатка, золотуха из-за характерных клинических признаков. Впервые отделил “чахотку” от других легочных заболеваний Рене Лаэннек в 1819 г., он ввел термин “туберкулез” (от лат. tuberculum – бугорок, отсюда синоним - бугорчатка).
В 1882 г. Р. Кох обнаружил возбудителя туберкулеза и получил чистую культуру на сывороточной среде (палочка или бацилла Коха). В 1890 г. Р. Кох получил туберкулин (“водно-глицериновую вытяжку туберкулезных культур”). В 1911 г. Р. Кох за открытие возбудителя туберкулеза был удостоен Нобелевской премии.

Mycobacterium
Виды: M. tuberculosis (tuberculum – бугорок)
М. bovis

M. leprae
M. kansassii
M. xenopi
M. ulcerans

0,3-0,6 * 1,0-4,0 мкм. Грамположительные. Окрашиваются по методу Циля-Нильсена

в красный цвет. Характерен выраженный полиморфизм. В основном они имеют форму длинных тонких (М. tuberculosis, М. africanum) или коротких и толстых (М. bovis) палочек с зернистой цитоплазмой, содержащей от 2 до 12 зерен различной величины (зерна метафосфатов – зерна Муха). Иногда они образуют нитевидные структуры, напоминающие мицелий грибов, что и послужило основанием для их названия (mykes - гриб и bacterium - бактерия). Неподвижные. Спор не образуют. Имеют микрокапсулу.

В клеточной стенке содержится большое количество липидов (миколовая кислота и липоиды – до 40% от сухого веса), что определяет следующие свойства: кислотоустойчивость (5-10% кислоты), устойчивость к щелочам и спирту, к высушиванию, УФ, дез. средствам.
Вызывают сенсибилизацию организма.

Оптимальное значение рН=6,8-7,2.
Размножение их происходит очень медленно, время

генерации – 14–16 ч. Это связано с выраженной гидрофобностью, которая обусловлена высоким содержанием липидов. Это затрудняет поставку питательных веществ в клетку, что снижает метаболическую активность клетки. Видимый рост на средах – 21–28 дней.
Микобактерии требовательны к питательным средам. Факторы роста – глицерин, аминокислоты. Растут на картофельно-глицериновых, яично-глицериновых и синтетических средах. Во все эти среды добавляют вещества, которые ингибируют рост контаминирующей флоры - красители (малахитовый зеленый) и антибиотики, не действующие на микобактерии.
На плотных питательных средах образуются характерные колонии: морщинистые, сухие, с неровными краями, не сливаются друг с другом (напоминают цветную капусту).
В жидких средах растут в виде пленки. Пленка сначала нежная, сухая, со временем утолщается, становится бугристо-морщинистой с желтоватым оттенком. Среда при этом непрозрачная.

Элективные питательные среды для микобактерий:
-яичные среды Левенштейна-Йенсена,
-глицериновые среды;
-картофельные среды с желчью;
-полусинтетическая среда Школьниковой;
-синтетические среды Сотона, Дюбо.

Яичная среда Левенштейна-Йенсена

формирования перегородки деления c последующим расхождением клеток.

макрофагами в процессе фагоцитоза, сохраняют свою жизнеспособность длительное время

и могут вызывать заболевание после нескольких лет бессимптомного существования.

Микобактерии туберкулеза могут образовывать L-формы, имеющие сниженный уровень метаболизма и ослабленную вирулентность. L-формы могут длительное время персистировать (сохраняться) в организме и индуцировать (вызывать) противотуберкулёзный (нестерильный) иммунитет.

Микобактерии туберкулеза могут существовать в виде очень мелких фильтрующихся форм, которые выделяются у больных, длительно принимавших противотуберкулёзные препараты.

восстанавливает нитраты, накапливает в среде ниацин (ниациновый тест Конно

– среда желтеет).

M. bovis тоже обладает уреазой,
но не восстанавливает нитраты,
не продуцирует
никотинаминидазу и не
накапливает в среде ниацин.

клетки: туберкулопротеин, липидные фракции, корд-фактор (высокотоксичен).
Ферменты: лецитиназа, каталаза, пероксидаза.
Структурные

и химические компоненты клетки:
Миколовая кислота – склеивает микобактерии, образует клетки Пирогова-Лангханса;
Корд-фактор – токсическое действие на ткани, блокирует окислительное фосфорилирование на митохондриях, защищает от фагоцитоза, подавляет миграцию лейкоцитов;
Липиды (фосфатидный фактор, фтионовая кислота, мураминдипептид, воск Д) и полисахариды - образование эпителиоидных клеток, специфические гранулематозные изменения в тканях;
Туберкулопротеин – развитие ГЗТ.

стеклах в жидкой среде (метод микрокультур Прайса), при котором

через 48-72 часа отмечается рост микобактерий в виде переплетенных девичьих “кос” или “жгутов” благодаря корд-фактору (англ. cord - жгут, веревка).

мокроте до 2 месяцев).
Рассеянный солнечный свет - 8-10

суток, прямой – 5 минут.
На белье, книгах – свыше 3 месяцев; в воде – более 1 года; в почве – до 6 месяцев; в желудочном соке – 6 месяцев; в масле – 10 месяцев.
Выдерживают температуру жидкого азота (-1900С), при кипячении погибает через 5-7 минут, 500С – 12 часов.
5% карболовая кислота, 1:1000 сулема – 1 сутки, 10% формалин – 12 часов, 5% фенол – 6 часов, 0,05% бензилхлорфенол – 15 минут.
Губительно действуют стрептомицин, рифампицин, тубазид, фтивазид, ПАСК.

человек и больные животные (крупный рогатый скот, верблюды, свиньи,

козы и овцы).
Основной механизм заражения – аэрогенный.
Пути передачи возбудителя - воздушно-капельный и воздушно-пылевой. Входные ворота – слизистая оболочка полости рта, бронхи и легкие. Реже заражение туберкулезом может происходить алиментарным (пищевым) путем при употреблении термически не обработанных мясо-молочных продуктов. Возможен контактно-бытовой путь передачи инфекции от больных туберкулезом при использовании инфицированной одежды, игрушек, книг, посуды и других предметов. Известны случаи заражения людей при уходе за больными животными.

туберкулиновыми пробами (в большинстве стран предпочтение отдается внутрикожному тесту

- реакции Манту)
В качестве аллергена используется туберкулин - фильтрат автоклавированной бульонной культуры M. tuberculosis.
Для пробы Манту используется очищенный белковый препарат туберкулина (ППД) (PPD= Purified Protein Derivative)
вызывает у инфицированных микобактериями людей местную воспалительную реакцию в виде инфильтрата и покраснения (реакция ГЗТ).
Неинфицированные люди никакой реакции на введение туберкулина не дают. Эту пробу применяют для выявления инфицированных, сенсибилизированных людей

эффективности вакцинации
Оценка течения туберкулезного процесса
При оценке туберкулиновых проб следует

иметь в виду:

положительный результат нельзя рассматривать как признак активного процесса
отрицательная реакция Манту не всегда указывает на отсутствие процесса, т.к. у больных с иммунодефицитами и анергией реакция обычно также отрицательна.

Bacille Calmette-Guerin) – содержит живые ослбленные микобактерии, полученные из

M.bovis путем многолетних пассажей на средах, содержащих желчь.
Вакцинируются дети в возрасте 5 - 7 дней (при ранней выписке из роддома - на 3 день) жизни. Ревакцинацию проводят лицам с отрицательной туберкулиновой пробой.
NB: у новорожденных со сниженной резистентностью применяют менее реактогенную вакцину BCG-M (с меньшим содержанием антигена).
Поствакцинальный иммунитет связан с формированием ГЗТ (гиперчувствительности замедленного типа).

Специфическая профилактика

ALBER CALMETT
(1862 – 1933)

делятся на 3 группы:
Группа А – изониазид, рифампицин
Группа В

– стрептомицин, канамицин, этионамид, циклосерин, фторхинолоны и др.
Группа С – ПАСК и тиоацетозон
курс лечения не менее года

Лечение

патологического материала, в том числе из мокроты, обогащенной гомогенизацией

или флотацией.

Бактериологический метод: посев на среду Левенштейна—Йенсена, Финн 2 и др., микрокультивирование по Прайсу (рост микроколоний при помещении мазка в жидкую питательную среду.

Биологическая проба: заражение морских свинок и кроликов.

Серологический метод: РНГА, ИФА; определяют антитела против комплекса антигенов клеточной стенки, липоарабиноманнана, гликолипидов, фибронектинсвязывающего антигена.

Кожно-аллергические пробы: внутрикожное введение туберкулина (проба Манту).

Молекулярно-генетический метод: ПЦР; метод генной дактилоскопии возбудителя — Саузерн-блот-гибридизация с использованием инсерционного элемента (IS) в качестве зонда.

Микробиологическая диагностика